蒼柏濕毒清及其拆方對解脲支原體感染小鼠IL—12影響

材料

11實驗對象

雌性BALB/c小鼠，清潔級，7周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于北京中醫藥大學東方醫院實驗中心動物實驗室。

12主要試劑、儀器

解脲支原體血清4型（美國模式培養物集存庫）；苯甲酸雌二醇（天津金耀氨基酸有限公司）；解脲支原體液體培養基（珠海麗珠試劑有限公司）；小鼠IL-12 ELISA試劑盒（美國R&D公司）；酶標儀MULTISKAN MK3（Thermo）；切片機RM2016（德國徠卡）；中草藥（北京中醫藥大學東方醫院草藥房）。

13中藥組成及劑量

蒼柏濕毒清組藥物由炒蒼術10g、黃柏10g、土茯苓15g、虎杖10g、白頭翁10g、馬齒莧15g、生薏苡仁30g、生黃芪10g、苦參10g、茯苓15g、白扁豆10g、馬鞭草10g、白花蛇舌草15g、敗醬草15g、丹參15g、柴胡10g組成，每劑210g；活血利濕組藥物由丹參15g、敗醬草15g、虎杖10g、馬鞭草10g組成，每劑50g；清熱解毒組藥物由黃柏10g、土茯苓15g、白頭翁10g、馬齒莧15g、白花蛇舌草15g、敗醬草15g、虎杖10g、馬鞭草10g、苦參10g、柴胡10g組成，每劑120g；健脾利濕組由蒼術10g、生薏苡仁30g、生黃芪10g、茯苓15g、白扁豆10g組成，每劑75g。

中草藥由北京中醫藥大學東方醫院制劑室制備成濃縮2g/mL濃度藥液。

2實驗方法

2.1動物分組

按隨機數字表將60只BALB/c小鼠隨機分成六組，即蒼柏濕毒清組、活血利濕組、清熱解毒組、健脾利濕組、模型組、空白組，每組10只。

2.2操作步驟

2.2.1菌液復蘇與傳代將解脲支原體血清4型凍干菌株用解脲支原體液體培養基1mL溶解稀釋，用移液器吸取其中02mL培養基放于18mL解脲支原體液體培養基中，然后倍比稀釋10次，置于37℃恒溫培養箱中培養48h。對培養基進行PH值檢測，選取PH為65±05的培養基，然后傳代，傳至第三代時配制成105CCU/mL的濃度備用。

2.2.2動物造模＼[7＼]每周在蒼柏濕毒清組、活血利濕組、清熱解毒組、健脾利濕組、模型組小鼠的皮下注射1次苯甲酸雌二醇注射液02mL，連續4周。第2次皮下注射雌二醇后，用無菌輸液軟管向以上BALB/c小鼠陰道注入預備的標準株菌液20μL，每天1次，連續3d。第4次注射完雌二醇后，取小鼠陰道分泌物檢測解脲支原體，放入解脲支原體液體培養基，在37℃條件下培養。若培養基顏色變紅即表明支原體檢測陽性，造模即成功。

2.23中藥灌胃小鼠平均體重為20g，用藥量為成人劑量的6倍。按成人平均體重為60kg計算，蒼柏濕毒清組每天劑量0105mL；活血利濕組每天劑量0025mL；清熱解毒組每天劑量00525mL；健脾利濕組每天劑量00375mL；中藥灌胃，每天2次，間隔6h，連續7d。

2.3樣品檢測＼[8＼]

藥物干預結束后2d，采用空氣靜脈栓塞處死BALB/c小鼠，立即用解剖刀和剪解剖會陰部，摘取陰道黏膜組織。加入500μL PBS溶液，勻漿。將組織勻漿液離心，采用ELISA法對上清液進行IL-12的定量檢測。

2.4數據處理

應用SPSS 200統計軟件，P<005為差異有統計學意義。

3實驗結果

3.1一般情況

BALB/c小鼠注射苯甲酸雌二醇注射液后出現不同程度的豎毛、精神不振、進食減少。接種解脲支原體后小鼠外陰分泌物多、紅腫；模型組小鼠外陰有明顯潰瘍、糜爛，伴黃色膿液；治療后蒼柏濕毒清組及健脾利濕組BALB/c小鼠外陰分泌物較之前減少?？瞻捉MBALB/c小鼠明顯較其它組小鼠活動活躍，毛色光滑，陰道無紅腫潰瘍。

實驗過程中，模型組-9 1只小鼠死亡，考慮注射雌二醇操作不當致死?？瞻捉M-1、空白組-4，2只小鼠不明原因死亡?；钛麧窠M-2、模型組-6，2只小鼠死亡，考慮為解脲支原體嚴重感染所致。蒼柏濕毒清-1、蒼柏濕毒清-7、清熱解毒組-6、健脾利濕組-2，4只小鼠因灌胃操作不當嗆咳死亡。

3.2陰道黏膜IL-12值

對各組數據進行Shapiro-Wilk正態性檢驗，蒼柏濕毒清組、活血利濕組、清熱解毒組、健脾利濕組、模型組、空白組的P值分別是0760、0892、0650、0776、0216、0814（P>005），均服從正態分布。

各組數據進行方差齊性檢驗，Levene統計量為1194，P值0327，認為六組方差齊性；對多組均數比較，采用單因素方差分析，F值為3952，P值為0005，六組BALB/c小鼠陰道黏膜組織IL-12不全相等，可以進行組間比較。

六組BALB/c小鼠陰道黏膜組織IL-12由高到低依次是模型組、清熱解毒組、活血利濕組、健脾利濕組、蒼柏濕毒清組、空白組。見表1。

表1各組BALB/c小鼠陰道黏膜IL-12均值組別數量均值±標準差（ng/L）蒼柏濕毒清組87719±3944*活血利濕組910128±3602△清熱解毒組911034±2988△健脾利組88757±2957*模型組812471±2547△空白組86662±2189*注：與模型組比較，*P<005；與空白組比較，△P<005

采用LSD檢測法，模型組分別與健脾利濕組、蒼柏濕毒清組、空白組進行組間兩兩比較，P值分別為0018、0004、0001。清熱解毒組分別與蒼柏濕毒清組、空白組進行組間兩兩比較，P值為0033、0006，差異有統計學意義?？瞻捉M與活血利濕組進行組間比較，P值為0026，差異具有統計學意義。蒼柏濕毒清組、健脾利濕組、空白組組間兩兩比較，差異無統計學意義；活血利濕組、清熱解毒組、模型組組間兩兩比較，差異無統計學意義。

實驗表明UU感染后BALB/c小鼠陰道黏膜組織的IL-12呈高水平。蒼柏濕毒清組、健脾利濕組可降低陰道黏膜組織IL-12的高水平，使之趨于正常水平。

實驗結論：蒼柏濕毒清及健脾利濕類藥物可降低解脲支原體感染小鼠陰道黏膜組織IL-12的高水平，可能是通過調節IL-12水平，以降低血管通透性，減少炎癥滲出，保持陰道黏膜屏障完整，從而在治療解脲支原體感染中發揮重要作用。

4討論

IL-12，屬白細胞介素中的一種，是目前已知對細胞免疫活性誘導和調節作用最強的多功能細胞因子。IL-12由單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原呈遞細胞產生，其中尤以樹突狀細胞為主。IL-12對多種免疫細胞有調控作用，如可刺激自然殺傷細胞生長，產生干擾素-γ＼[9＼]；增強細胞毒性淋巴細胞的細胞毒活性；促進Th0向Thl分化進而激活細胞毒T細胞（cTL），促發Thl類細胞因子的產生、抑制Th2類細胞因子產生，促發以細胞免疫反應為主、體液免疫為輔的免疫反應類型，以適應機體對腫瘤、病毒及胞內寄生菌的攻擊＼[10＼]。

慢性肝病患者乙型肝炎病毒（HBV）復制水平與IL-12表達水平呈正相關關系。對慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者進行血清IL-12檢測，結果表明慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化組血清IL-12水平明顯高于對照組（P<005）；慢性乙型肝炎、肝硬化患者HBV-DNA高復制組（HBV-DNA>105·mL-1）血清IL-12表達水平明顯高于HBV-DNA陰性組（HBV-DNA<103·mL-1）（P<005）＼[11＼]。吳亞斌等＼[12＼]進行了相似研究，慢性乙型肝炎患者血清IL-12水平高于對照組（P<001）；慢性乙型肝炎重度患者血清IL-12水平較輕中度患者顯著增高（P<001）。HBV復制程度越活躍，慢性肝病患者IL-12表達水平越高。同HBV感染相似，感染蒼白螺旋體后，患者血清IL-12亦呈動態變化。對早期患者血清IL-12水平進行檢測，一期梅毒患者IL-12水平與治療有效的患者及正常組之間差異無顯著性（P>005）；二期梅毒患者及早期潛伏梅毒患者血清IL-12水平低于正常組、一期梅毒患者及治療有效患者（P<005）。一期梅毒時IL-12水平未降低，可刺激Th1細胞增殖，維持細胞免疫；當進入二期梅毒時患者血清IL-12水平降低，可導致Th1細胞減少，細胞免疫抑制，不能清除蒼白螺旋體，使疾病慢性發展＼[13＼]。蒼白螺旋體越活躍，梅毒患者血清IL-12水平越高。

HBV病毒的活躍與病毒內的DNA復制有關。HBV由雙層衣殼和核心組成，核心部分含有環狀雙股DNA和具有逆轉錄酶活性的DNA聚合酶＼[14＼]。HBV進入肝細胞內，脫去衣殼，核心內的DNA進入肝細胞核。在DNA多聚酶的作用下，DNA進行復制、轉錄、翻譯，核心包裹衣殼后完成病毒體的復制。蒼白螺旋體是原核生物，遺傳物質是DNA。蒼白螺旋體屬螺旋體科密螺旋體屬，其基本結構和生物學性狀與細菌相似，有細胞壁及核質＼[15＼]；生活周期分為顆粒期、球形期、螺旋體期。蒼白螺旋體的發育周期與梅毒的周期、慢性病程、發病程度有關，即蒼白螺旋體內DNA復制越活躍，梅毒發展越迅速，病情越不穩定。UU是介于細胞與病毒之間的原核微生物，同HBV及蒼白螺旋體相同遺傳物質為DNA。UU的繁殖速度與DNA活躍程度密切相關，UU繁殖速度越快，DNA復制程度越活躍。UU內大量DNA復制可刺激細胞免疫，刺激Th1細胞、自然殺傷細胞增多，增殖的Th1可導致IL-12水平升高。本實驗中模型組小鼠陰道分泌物明顯比其他組小鼠陰道分泌物多，且伴有局部黏膜出現潰瘍、糜爛，為UU大量繁殖的結果。感染UU后小鼠細胞免疫增強，增殖的Th1細胞可大量產生干擾素-γ、IL-12等細胞因子，導致炎癥明顯，使得外陰糜爛、滲出。蒼柏濕毒清及健脾利濕類藥物通過調節免疫，抑制UU內DNA的復制，導致IL-12水平恢復正常，局部黏膜炎癥減輕。

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（收稿日期：2014-08-14）