FZD10,對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

吳小鳳，程大釗，詹日明，陳 黎，王天雨，余 華，張桂洪，唐旭東* （1.廣東醫科大學抗腫瘤活性物質研發協同創新中心，廣東湛江 524023；
2.廣東醫科大學附屬醫院檢驗醫學中心，廣東湛江 524001；
3.廣東醫科大學生物化學與分子生物學研究所，廣東湛江 524023）

肺癌是最常見的癌癥[1]，死亡率居惡性腫瘤之首[2-3]。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC 約占85%，侵襲、轉移是NSCLC 致死的重要因素之一。FZD10 是Frizzle（FZD）家族中的一員，為類G 蛋白偶聯受體。目前已有文獻報道FZD10 在骨肉瘤[4]、胃癌[5]、滑膜肉瘤[6]等癌組織中高表達，而且還發現FZD10 與神經細胞、腫瘤細胞的增殖[7-8]及腫瘤的侵襲、轉移有關[8-9]。Gugger 等[10]也證實FZD10 在肺鱗癌中高表達，但FZD10 在NSCLC 細胞增殖、侵襲、轉移中的作用仍不清楚。因此，本文擬對此進行分析，以期進一步了解NSCLC 侵襲、轉移的分子機制，為尋找NSCLC 防治的潛在靶點提供參考依據。

1.1 細胞株

正常人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司（iCell Bioscience Inc）；
NSCLC 細胞株A549 和H1299 來自美國菌種保藏中心（ATCC）；
NSCLC 細胞株95C、95D、H460購自中國科學院細胞庫，H1703 和PC-9 由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

兔抗人FZD10 抗體和兔抗人MMP-2 抗體為英國Abcam 公司產品；
兔抗人MMP-9 抗體為北京Bioss 產品；
結晶紫、CCK8 試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒均購自碧云天生物科技公司；
Matrigel 基質膠為美國BD 公司產品；
RT-qPCR 相關試劑PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司（大連TaKaRa 公司）；
FZD10-siRNA 及轉染試劑DharmaFECTTM Transfection Reagents-SiRNA 均購自美國Thermo 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 NSCLC 細胞（H1299、A549、H460、H1703、PC-9、95C、95D）和BEAS-2B 細胞置于含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養液中，37 ℃、5% CO2條件下傳代培養。

1.3.2 細胞轉染 參照美國Thermo 公司轉染試劑DharmaFECTTM Transfection Reagents-SiRNA 說明書進行操作，在95D 細胞中轉染FZD10-siRNA，并將細胞分成3 組：（1）模擬轉染組（Mock）：僅加轉染試劑；
（2）非特異siRNA 轉染組(Si-CTR)：轉染非特異siRNA；
（3）FZD10-siRNA 轉染組（Si-FZD10）：轉染特異性FZD10-siRNA。在所有轉染實驗中FZD10-siRNA 的終濃度均為25 nmol/L，在96 孔板中加入FZD10-siRNA 2.5 pmol，在6 孔板中加入FZD10-siRNA 50 pmol。

1.3.3 CCK8 細胞增殖實驗 將100 μL 95D 細胞懸液接種于96 孔板（細胞數為2 500 個/孔）培養12 h 后轉染，分別在24、48、72 h 時更換培養基為含有CCK8試劑的完全培養基100 μL，培養1～2 h，在波長為450 nm 條件下檢測吸光度值。

1.3.4 遷移、侵襲實驗 將95D 細胞接種到6 孔板中，瞬時轉染FZD10-siRNA 24 h 后，將已轉染細胞用胰酶消化、離心、去上清，再用含10% FBS 的基礎培養基重懸細胞沉淀并制成細胞懸液；
在Transwell 板的下室緩慢加入700 μL 完全培養基（避免出現氣泡），上室（侵襲實驗應提前包被Matrigel 基質膠）加入細胞懸液（細胞數為30 000 個/孔），每孔細胞懸液體積不超過200 μL。培養24 h 后，用棉簽擦拭上室，于4%多聚甲醛中固定25～30 min，再用結晶紫在室溫下染色10 min，清洗、晾干后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。結果使用Image J 軟件進行分析。

1.3.5 Western blot 使用強RIPA 裂解液分別裂解3 組轉染細胞，提取總蛋白，使用BCA 法檢測蛋白原液濃度，再進行SDS-PAGE 電泳（100 V 電泳約2 h），轉膜、電轉（100 V 電轉1.5 h）、封閉；
分別加兔抗人FZD10、MMP-2、MMP-9 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜后，用PBST 緩沖液洗滌3 次；
用HRP 標記的第二抗體（1∶2 000）常溫孵育1～2 h，再用PBST 緩沖液洗滌3 次；
用ECL 化學發光檢測信號，Image J 軟件進行灰度值分析，將GAPDH 用作內參對照。

1.3.6 RT-qPCR 使用Trizol 分別裂解3 組轉染細胞，提取總RNA，選擇A260/ A280為1.8～2.0 的樣品，RTqPCR 操作參照文獻[11-12]。FZD10 的擴增引物序列為F:5′-AGCAGGTCTCTACCCCCATC-3′和R: 5′-TAATC GGGGAGCACTTGAGC-3′（GenBank No.NM_007197.4），GAPDH 的擴增引物序列為F: 5′-ATGAATGGGCAGC CGTTAGG-3′和R: 5′-CCCAATACGACCAAATCAGA-GAT-3′（GenBank No.NM_001256799.2），所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增條件為42 °C 5 min，95 °C 10 s，再 40 個循環（95 °C 5 s,60 °C 31 s）。結果以2-△△Ct對擴增產物進行相對定量分析，GAPDH 為內參對照。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計學分析，所有實驗均重復3 次，數據以表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2.1 FZD10 在NSCLC 細胞中的表達

Western blot 結果（圖1）顯示：與BEAS-2B 細胞相比，除A549 和H460 細胞外，在其他NSCLC 細胞H1299、95D、95C、H1703、PC-9 中的FZD10 蛋白水平明顯升高，特別是在95D 細胞中表達最高，因此我們選擇該細胞進行后續實驗。

圖1 NSCLC 細胞和正常肺上皮細胞的FZD10 表達

2.2 FZD10 敲低對95D 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

從圖2 可見，在95D NSCLC 細胞中敲低FZD10，與Mock 組和Si-CTR 組比較，Si-FZD10 組細胞的FZD10 蛋白和mRNA 的表達都明顯受抑（P＜0.05 或0.01），說明FZD10 在95D 細胞中被成功敲低。CCK8檢測結果（圖3）顯示：Si-FZD10 組細胞的增殖被抑制，且在轉染72 h 時抑制顯著（P＜0.05）；
Transwell 小室實驗結果（圖4、5）顯示：Si-FZD10 組細胞的遷移和侵襲能力明顯降低（P＜0.01），而Mock 組和Si-CTR組細胞的遷移、侵襲能力差異無統計學意義（P＞0.05），說明FZD10 的敲低可抑制95D 細胞的增殖、遷移和侵襲。

圖2 FZD10 的敲低效果分析

圖3 敲低FZD10 對95D 細胞增殖能力的影響（n=3，*P＜0.05）

圖4 敲低FZD10 對95D 細胞遷移能力的影響

圖5 敲低FZD10 對95D 細胞侵襲能力的影響

2.3 FZD10 敲低對95D 細胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表達的影響

圖6 可見，與Mock 組、Si-CTR 組比較，Si-FZD10組細胞的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 敲低FZD10 對95D 細胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表達的影響

NSCLC 是臨床上常見的惡性腫瘤，盡管近年來由于靶向藥物和免疫治療的臨床應用使NSCLC 的療效顯著提高[13-14]，但NSCLC 發病機制復雜，涉及的信號分子繁多，治療后的NSCLC 還是面臨較大的復發和轉移的風險，而目前有關肺癌轉移的分子機制還不完全清楚。

FZD10 是Frizzle 家族中的一種蛋白受體。研究發現其在肺鱗癌等多種腫瘤組織中表達上調[4-6，10]。但最近Zhang 等[15]卻報道在45 歲以下的NSCLC 患者組織中FZD10 mRNA 的表達下調，這與Gugger 等[10]所報道的FZD10 在肺鱗癌中過度表達不一致。這些報道結果的差異說明FZD10 在NSCLC 中的表達還存在爭議。為進一步證實FZD10 在NSCLC 中的表達情況，本文采用Western blot 技術分析了NSCLC 細胞株中FZD10 蛋白的表達，結果發現FZD10 蛋白在NSCLC 細胞株H1299、95C、95D、H1703、PC-9 中都呈現高表達（圖1）。

有研究顯示，FZD10 的表達與Survivin 的表達相關，且兩者的高表達可作為骨肉瘤診斷、惡性程度判斷的重要指標[4]；
而且，通過綜合分析TCGA 與GEO甲基化數據發現FZD10 可能為膽管癌預后的相關基因[16]；
特別是FZD10 的表達還被報道可影響胃癌細胞的增殖和侵襲能力[5]，并且可能成為滑膜肉瘤[6]、結腸癌[17]治療的靶點。這些報道說明，FZD10 在腫瘤的發生、發展中具有重要作用。本文發現FZD10 蛋白在具有高轉移潛能的NSCLC 細胞95D 中表達最高（圖1），初步說明FZD10 表達可能與NSCLC 轉移有關。

為進一步探討FZD10 在NSCLC 轉移中的作用，本文通過RNA 干擾技術敲低95D 細胞中FZD10 的表達，分析FZD10 對NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲的影響。結果發現，用特異性FZD10-siRNA 敲低FZD10 后，可以明顯抑制95D 細胞的增殖（P＜0.05，圖3）、遷移（P＜0.01，圖4）和侵襲能力（P＜0.01，圖5），提示FZD10可能在NSCLC 轉移中起重要作用。

基質金屬蛋白酶屬鋅依賴性內肽酶家族，其中MMP-2、MMP-9 與基底膜降解、血管生成相關，參與調控腫瘤的侵襲轉移過程[18]。為研究FZD10 增強NSCLC 細胞95D 增殖、遷移、侵襲能力的機制，本文進一步分析了FZD10 對NSCLC 細胞MMP-2 和MMP-9 表達的影響，結果表明敲低FZD10 后95D細胞中MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達均顯著降低（P＜0.05，圖6）。本文結果初步說明，FZD10 可能通過上調MMP-2 和MMP-9 的表達增強NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進NSCLC 轉移，提示FZD10 可能是NSCLC 防治的潛在靶點。