聯合應用常染色體STR和SNP排除半同胞關系1例

徐倩南，朱如心，姜磊，李成濤，劉希玲

1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海 200063；
2.河南科技大學基礎醫學與法醫學院，河南 洛陽 471000

1.1 簡要案情

宋某（男性）和魏某（女性）委托本院對兩者之間有無生物學半同胞關系進行檢驗。

1.2 檢驗過程

按照《法庭科學DNA 實驗室檢驗規范》（GA/T 383—2014）對兩名被鑒定人（宋某和魏某）的血紗布進行DNA 提取。

1.2.1 常染色體STR 基因座檢測

分別采用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統（司法鑒定科學研究院研發）、Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC［基點認知技術（北京）有限公司］和21+1 STR 熒光檢測試劑盒（無錫中德美聯生物技術有限公司）對兩名被鑒定人的常染色體短串聯重復序列（autosomal-short tandem repeat，A-STR）基因座進行復合PCR 擴增，用3130xl基因分析儀（美國Applied Biosystems 公司）進行毛細管電泳和基因型分析。

1.2.2 常染色體SNP 位點檢測

采用ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒（美國Verogen公司）的引物混合物A對兩名被鑒定人的94個常染色體單核苷酸多態性（autosomal-single nucleotide polymorphism，A-SNP）位點進行文庫構建，用MiSeq FGx 測序系統（美國Verogen 公司）進行高通量測序和基因型分析。由于檢測所用的引物混合物A中除含94 個A-SNP 外，還含27 個A-STR，因此同時還得到27 個A-STR 的分型信息，這27 個A-STR 均包含在1.2.1 節所述的三款A-STR 檢測試劑盒所測基因座中。

1.2.3 指數計算

采用似然比法[1]計算半同胞指數（half sibling index，HSI）和累積半同胞指數（cumulative half sibling index，CHSI）。

1.3 檢測結果

1.3.1 A-STR 檢測結果

利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統檢測了21 個A-STR，其CHSI 值為0.001 7。利用Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC 檢測了21 個A-STR，其CHSI 值為0.241 6。利用21+1 STR 熒光檢測試劑盒檢測了21 個A-STR，其CHSI 值為6.943 9。去除三款試劑盒中的重復基因座，共含55 個A-STR（表1），其CHSI 值為0.008 9。

表1 55 個A-STR 的分型結果Tab.1 Typing results of 55 A-STRs

1.3.2 A-SNP 檢測結果

ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒的引物混合物A 檢測了94 個A-SNP，除13 個A-SNP 未在兩名被鑒定人中成功得到分型結果外，其余81 個A-SNP的分型結果均成功獲得（表2），經計算，其CHSI 值為0.006 9。

表2 81 個A-SNP 的分型結果Tab.2 Typing results of 81 A-SNPs

1.3.3 聯合應用A-STR 和A-SNP 的HSI 計算結果

聯合應用A-STR 和A-SNP 分型結果計算CHSI，其中：（1）利用ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得27 個A-STR 和81 個A-SNP，其CHSI 值為6.483 3×10-5；
（2）利用21+1 STR 熒光檢測試劑盒的21 個ASTR和ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒所得81個A-SNP，其CHSI值為0.048 2；
（3）利用Goldeneye?DNA身份鑒定系統22NC 的21 個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP，其CHSI 值為0.001 7；
（4）利用21+1 STR 熒光檢測試劑盒和Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC 兩個試劑盒的37 個ASTR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒所得81個A-SNP，其CHSI值為0.004 6；
（5）利用SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統的21 個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81個A-SNP，其CHSI值為1.148 3×10-5；
（6）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統和Goldeneye?DNA身份鑒定系統22NC的39 個A-STR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep 試 劑盒所得81 個A-SNP，其CHSI 值為1.022 9×10-5；
（7）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統和21+1 STR熒光檢測試劑盒的40 個A-STR 以及ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP，其CHSI 值為4.649 0×10-5；
（8）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統、Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC 和21+1 STR 熒光檢測試劑盒的55 個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP，其CHSI 值為6.181 6×10-5。

1.4 鑒定意見

聯合應用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統、Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC 和21+1 STR 熒光檢測試劑盒的55個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP 的分型結果計算，可得CHSI值為6.181 6×10-5。依據現有資料和DNA 分型結果綜合分析，傾向于認為宋某與魏某為無關個體。

生物學半同胞關系鑒定在日常檢案中的數量逐年增多，但由于技術手段的限制和相應鑒定規范的缺乏，一直以來是司法鑒定實踐中的難點。通常，包括半同胞關系鑒定在內的復雜親緣關系鑒定可根據多個被鑒定人進行家系重建，并根據A-STR 分型結果推斷父母基因型，從而推斷被鑒定人之間的親緣關系[2]。也有學者[3-6]提出同時檢測A-STR、性染色體STR 或mtDNA 來進行半同胞關系的判定。本例中只有兩人參與鑒定，且性別不同，使得Y-STR 無法發揮其應用價值，X-STR 的應用價值也極為有限[4]。通過mtDNA 高變區（hypervariable region，HVR）Ⅰ和Ⅱ的序列分析僅可在同母異父半同胞關系鑒定中用于輔助推斷，無法為半同胞關系的認定提供有力證據[4]，同時，mtDNA 全序列的測定需在二代測序平臺上進行[3，7]，對樣本質量要求較高。本例樣本為帶血紗布，所含血樣較少，無法滿足測定mtDNA 全序列對樣本的要求。因此，聯合應用多種常染色體遺傳標記成為解決本例的重要策略，已有研究[8-9]報道聯合應用ASTR 和A-SNP 可為半同胞關系鑒定提供可靠依據。

基于上述分析，本例選用三款A-STR 分型試劑盒以及基于MiSeq FGx 測序系統的ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒，其中ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒可 同時檢測27 個A-STR 和94 個A-SNP，其靈敏度可低至200 pg[10]，對樣本質量的要求較低，但本例樣本為帶血紗布，所含血樣較少，使得提取所得DNA 量極其有限，因此，在系統默認參數下成功得到81 個A-SNP 的分型結果，依然有13 個A-SNP 未得到分型結果。本例在對分型結果進行統計分析時，還計算了各個試劑盒分型結果下的CHSI 值。ZHANG等[9]研究了聯合使用21+1 STR 熒光檢測試劑盒和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒在親緣關系鑒定方面的價值，由于ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒可同時檢測27 個A-STR，其中有8 個與21+1 STR 熒光檢測試劑盒共有，因此最終探討了40 個ASTR 和91 個A-SNP 在親緣關系鑒定中的應用，計算了全同胞關系指數和部分二級親緣關系指數，并通過設定單邊閾值判定親緣關系，結果表明，將閾值設定為1、10、100 或1 000 時，判定二級親緣關系的靈敏度、特異性和準確性均無法達到100%。LI 等[8]研究ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒在提高親緣關系鑒定效能的表現時，通過計算所測27 個A-STR 和94 個A-SNP 的似然率，設置雙邊閾值來判定個體之間的親緣關系。在判定二級親緣關系時，將較低閾值設定為0.000 1，較高閾值設定為10 000，即當二級親緣關系指數小于0.000 1 時判定兩者為無關個體，當二級親緣關系指數大于10 000 時判定兩者為二級親緣關系，以此使得整個檢測系統的陽性預測值（指被正確判定為有關系個體的比例）和陰性預測值（指被正確判定為無關個體的比例）均達到100%。半同胞關系屬于二級親緣關系的一種，本例通過聯合使用55 個A-STR 和81 個A-SNP，得到CHSI 值為6.181 6×10-5，小于0.000 1，傾向于認為兩者為無關個體。

此外，聯合應用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統和21+1 STR 熒光檢測試劑盒的40 個A-STR以及ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP 或聯合應用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統和Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC 的39 個A-STR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒所得81 個A-SNP，也傾向于認為兩者為無關個體。甚至僅聯合應用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統的21 個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試 劑盒所得81 個A-SNP，所得CHSI 值也小于0.000 1，同樣傾向于認為兩者為無關個體。若單獨使用ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得27 個A-STR 和81 個A-SNP 計算，也得出相同的結論，且相較于SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統的21 個A-STR，還增加了6 個A-STR（D17S1301、D20S482、D22S1045、D2S441、D4S2408和D9S1122）。而聯合應用21+1 STR 熒 光檢測試劑盒的21 個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP 或Goldeneye?DNA身份鑒定系統22NC 的21 個A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP，無法得出可靠結論。同樣的，聯合應用21+1 STR 熒光檢測試劑盒和Goldeneye?DNA 身份鑒定系統22NC 的37 個ASTR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個A-SNP，也無法得出可靠結論。由此可見，僅增加所測常染色體基因座的數量有時并不能達到提高親緣關系鑒別能力的目的。本例首先考慮使用基于毛細管電泳平臺的三款試劑盒以期得出結論，在發現使用55 個A-STR 無法得到明確結論后，再采用二代測序試劑盒加測A-SNP，從而在保證節省人力物力的情況下得到更多信息來支撐最終的鑒定意見。

近年來，隨著檢測技術的提高，越來越多的遺傳標記可通過二代測序平臺進行測定，大大提高了包括半同胞關系鑒定在內的復雜親緣關系的檢測效能。但在實際案件中，應根據案件的獨特性挑選適合的遺傳標記進行檢驗，而不是一味追求遺傳標記數量的增多。目前關于半同胞關系鑒定的相關研究依然較少，且無針對性的行業標準頒布，使得半同胞關系的甄別依然存在較大的風險，因此，在今后的類似案件中，應根據情況結合多方數據綜合分析判斷。