一株野生金針菇菌種的分離、鑒定與生物學特性研究

馮連榮,張 妍,趙鑫聞,宋立志,梁德軍

(1.遼寧省楊樹研究所,遼寧 蓋州 115213; 2.遼寧省經濟林研究所,遼寧 大連 116030)

金針菇(Flammulinafiliformis)是一種常見的食、藥用菌,在現代真菌分類系統上,屬于擔子菌類層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)白蘑科(Tricholomataceae)金針菇屬(Flammulina)[1],在自然界中分布廣泛,在中國北起黑龍江省,南至云南省,東起江蘇省,西至新疆維吾爾自治區均適合金針菇的生長。金針菇是一種木材腐生菌,易生長在柳、榆、白楊樹等闊葉樹的枯樹干和樹樁上。金針菇營養豐富,富含多種氨基酸、蛋白質、維生素和礦物質,其中賴氨酸和精氨酸含量尤其豐富,賴氨酸含量對兒童智力和生長發育有良好的促進作用,具有“增智菇”的美譽[2]。金針菇還富含維生素B1、維生素B2、尼克酸、維生素E和維生素C等多種維生素,且富含鈣、硒、磷、鐵等多種礦物質,其體內多糖具有較好的抗腫瘤作用[3-4]。此外,金針菇還具有提高免疫力、降低膽固醇、保護肝和調節機體代謝水平的作用[3,5],具有相當廣闊的開發和應用前景。

目前,關于金針菇的研究主要圍繞人工栽培[6-8]、工廠化栽培[9-12]、遺傳育種[13-15]、開發利用[16-22]等方面。隨著人們生活水平的不斷提高,對食品的營養、健康和風味等重視程度也越來越高[23],野生食用菌備受青睞,已成為餐桌上人們爭相品嘗的美味。但無序采摘、過度采摘導致野生食用菌資源遭到空前破壞,開展野生食用菌人工馴化勢在必行。本研究以采集于楊樹樹樁上的大型真菌為研究對象,通過菌種分離、形態學和分子生物學鑒定、出菇試驗,確定該菌種為金針菇。通過單因素試驗,研究不同條件對金針菇菌絲生長的影響,為金針菇開發利用提供候選菌種資源。

1.1 供試菌種

供試菌種子實體于2015年4月23日采集自遼寧省凌海市金城苗圃,子實體長于楊樹樹樁上。

1.2 培養基與試劑

PDA培養基:馬鈴薯200 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂20 g·L-1,pH值自然,121 ℃滅菌20 min備用。用于菌種培養、擴繁,以及pH值、溫度篩選試驗。

基礎培養基:葡萄糖20 g·L-1,尿素2 g·L-1,磷酸二氫鉀1 g·L-1,硫酸鎂0.5 g·L-1,瓊脂20 g·L-1,pH值自然,121 ℃滅菌20 min備用。用于碳源、氮源、無機鹽和維生素篩選試驗。

快捷型植物基因組DNA提取系統(非離心柱型)、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;ExTaq酶、DL2000 marker、大腸埃希菌(Escherichiacoli)JM109感受態細胞、pMD?-18-T vector購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 菌種分離、純化

采用組織分離法[24]進行菌種分離,于超凈工作臺內取子實體菌蓋與菌柄交界處組織塊,接種至PDA培養基中,置于25 ℃培養箱中黑暗靜置培養,菌絲直徑達到2 cm左右,進行轉接、純化培養,獲得純種菌絲,將該菌種命名為JC423。獲得菌種置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態學鑒定

對采集的子實體大小、菌蓋形狀、顏色、菌褶顏色、菌柄著生方式、質地、孢子印顏色、菌絲顏色等進行測量和記錄,參考相關文獻[2,25]對JC423進行初步分類。

采用玻片培養法[26]觀察JC423的菌絲形態。菌絲培養結束后,用OLYMPUS BX51顯微鏡觀察菌絲有無隔膜,有無鎖狀聯合、孢子形狀等。

1.4.2 出菇試驗

JC423采集自楊樹樹樁上,為了驗證菌種分離的正確性,設計以木屑、玉米芯為主料的栽培配方,進行出菇試驗,配方設計如下:配方1,木屑78%、麩皮20%、石膏1%、糖1%;配方2,玉米芯70%、木屑20%、麩皮8%、石膏1%、糖1%;配方3,木屑40%、玉米芯38%、麩皮20%、石膏1%、糖1%;配方4,木屑70%、麥麩15%、玉米粉13%、石膏1%、糖1%。

接種后,置于25 ℃進行發菌期培養,觀察是否長出子實體。

1.4.3 分子生物學鑒定

用ITS序列進行菌種JC423的分子鑒定。用天根快捷型植物基因組DNA提取系統(非離心柱型)進行菌絲DNA提取,利用NanoPro 2010超微量紫外分光光度計測定DNA濃度,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照馮連榮等[26]的反應體系和反應程序進行ITS序列PCR擴增。PCR產物經過凝膠回收,連接至克隆載體pMD?-18-T vector,并轉化至大腸埃希菌JM109中,經過藍白斑篩選和PCR檢測,將陽性克隆送至TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司進行測序驗證。測序結果登錄NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對,下載相似性序列的ITS區域,用Clustalw進行多序列比對,并輔以人工修正,分析時所有參數均為軟件默認值。用MEGA7.0軟件的N-J(Neihbor-Joining)法構建系統發育樹,構建發育樹時進行自舉檢驗,重復抽樣1 000次。

1.5 生物學特性研究

采用單因素試驗,研究不同碳源(果糖、甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖,以不添加碳源為對照)、氮源(蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨、尿素,以不添加氮源為對照)、無機鹽(氯化鈉、硫酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀,以不添加無機鹽為對照)、維生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12,以不添加維生素為對照)、pH值(4、5、6、7、8、9、10)和溫度(5、10、15、20、25、30、35 ℃)對JC423菌絲生長的影響。每種處理重復4次,當其中一個處理菌絲長滿培養皿時結束試驗,每天測量菌絲餅直徑,計算菌絲生長速度,同時觀察菌絲長勢、濃密度等生長指標。

v=d/t。

(1)

式(1)中:v表示菌絲生長速度,mm·d-1;d表示菌絲直徑,mm;t表示培養時間,d。

1.6 數據處理

用Excel軟件整理數據,用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析,采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2.1 純種菌絲獲得

對采集的子實體(圖1-A)進行菌種分離,2 d后可見白色菌絲長出,轉接純化3次,獲得純種菌絲,將菌種命名為JC423(圖1-B)

圖1 JC423子實體和菌落(正面)Fig.1 Sub-entity and colony (front) of JC423

2.2 菌種形態學鑒定

采集的子實體中等大,菌蓋直徑1.5 cm左右,呈球形或呈扁半球形,菌蓋黃褐色,菌肉白色,中央厚,邊緣薄,菌褶白色或象牙色,較稀疏,長短不一,與菌柄離生。菌柄中央生,中空圓柱狀,稍彎曲,長3.5～5.0 cm,直徑0.3～1.5 cm,菌柄基部相連,上部呈肉質、下部為革質,表面密生黑褐色短絨毛,孢子印白色。初步將采集菌種JC423鑒定為金針菇。在PDA平板培養基上JC423菌落白色平展、邊緣整齊,菌絲較密、不產生色素,菌絲有隔、分枝和鎖狀聯合,孢子無色、圓柱形(圖2)。

圖2 JC423 菌絲和孢子Fig.2 Hyphae and spores of JC423

2.3 子實體獲得

4個栽培配方均獲得了子實體,且與野外采集的子實體形態特征相符(圖3)。各配方菌絲長滿袋時間相差不大(表1),平均單袋產量在148.44～330.15 g,生物學效率為29.68%～65.18%。

表1 JC423出菇情況Table 1 Fruiting of JC423

圖3 JC423室內出菇情況Fig.3 Indoor fruiting situation of JC423

2.4 分子生物學鑒定

2.4.1 ITS序列PCR擴增結果

瓊脂糖凝膠電泳檢結果表明,JC423菌絲DNA單一無雜質,無降解,濃度為734.68 μg·mL-1,D260/D280約為2,說明DNA質量較好,可以作為PCR反應模板。PCR反應擴增出約700 bp的目的片段(圖4),經過連接、轉化、藍白斑篩選,隨機挑取14個白色菌落進行菌液PCR,其中有7個擴增出目的條帶,將擴增出目的條帶的3個陽性克隆送至TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司進行測序。

M,DL 2000 marker;CK,水對照;1～6,JC423 PCR產物。M, DL 2000 marker; CK, Water control, 1-6, JC423 PCR products.圖4 JC423 ITS序列PCR產物擴增電泳圖Fig.4 PCR amplification electrophoresis of ITS seqence from JC423

2.4.2 序列分析與進化樹分析

目的片段序列測定結果顯示,片段長度為773 bp,將測序結果在NCBI進行BLAST比對,相似性最高的是F.filiformisstrain F007;搜索獲得100條相似性序列,主要菌種為F.filiformis(金針菇)和F.velutipes(毛柄金錢菌)2種,下載部分相似性序列,利用MEGA 7.0軟件構建進化樹,JC423與序列號為MN337400.1的F.filiformisstrain F007聚為一支(圖5),結合形態學特征將JC423鑒定為F.filiformis。測序結果為TCCGTAGGTGAACCTGCG GAAGGATCATTAATGAACTTTGAACTGCTTGTGGCTCTTTGGGCTGTTGCTGACGACGACCTTCACGGGTTTTCGTACGTGCACGTCTGGGGTTGCAGCTTTCTTCGTCCACCTGTGCACACTCTGTAGGTCTGGATACCCCATTGGAAGGGTGCGCTTTTTGCGCTCCCTTTGCCTTCCAGGCCTATGTCTTATAAACACTATAGTATGTAACGAATGTCATTGATTATTGGACTTCACTGTCCTTTAAACTAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTACTCCGAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCAGTAACTTCTCAACCTCCCTCACTTTGTTGTGAGCTGGCGGATTGGACGTGGGGGCTTGCTGGACCTTATCTTTGGGTTCAGCTCCCCTGAAATGCATTAGCAGAAACCGTTACCTTTTGGCGCGCTGCAGCTGTGATAATTATCTACGGCTATGGCTGGGCTGACTGTGTTGTAGCGCTCGTCTCGTCTCTGAAGTGGTTTCGCCTTAGTTGGTGCTTCCCTTTGCCTTCTCTCTCACGAGAGATACCTGTGACGCGAGTGCGCGGGCTATTCCGCTTCTAACCGTCCCCTTGTGGGACAACTATTGACCATTGACCTCAAATCAGTAGACAGCCAGTTCCG。

圖5 基于ITS序列的JC423與其他菌種的進化樹Fig.5 Evolutionary tree of JC423 and other stains based on ITS sequences

2.5 JC423生物學特性

2.5.1 不同碳源對菌絲生長的影響

5種碳源均可以被JC423菌絲所利用(表2),其中,果糖為碳源時菌絲長勢旺,菌絲健壯而濃密,其次是甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖;甘露醇作為碳源時菌絲密度不如可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖。培養基中不加碳源時,菌絲可以生長,但菌絲生長較慢,菌絲密度顯著小于添加碳源的培養基。

表2 不同條件對金針菇菌絲生長的影響Table 2 Effects of different conditions on mycelial growth of Flammulina filiformis

2.5.2 不同氮源對菌絲生長的影響

培養基中有無氮源菌絲均可生長,但菌絲生長有差異(表2)。菌絲在蛋白胨和酵母膏作為氮源的培養基上生長快,菌絲濃密、健壯,菌絲生長速度顯著快于其他氮源培養基,其次是以硫酸銨作為氮源的培養基,菌絲生長較好。以尿素作為氮源時,菌絲生長較慢,但是菌絲長勢尚可。不加氮源時菌絲生長速度慢,菌絲稀薄長勢弱。綜上,宜選擇蛋白胨作為JC423菌絲培養的氮源。

2.5.3 不同無機鹽對菌絲生長的影響

JC423菌絲在添加各種無機鹽的培養基中均長勢良好,各無機鹽對菌絲生長影響差異不顯著(表2),說明金針菇菌絲生長不受無機鹽的影響。

2.5.4 不同維生素對菌絲生長的影響

JC423菌絲在添加不同維生素的培養基中和對照培養基中均長勢良好,是否添加維生素對金針菇菌絲生長影響不大,各處理菌絲生長速度差異不顯著,菌絲密度和長勢也無顯著差異(表2)。

2.5.5 不同pH值對菌絲生長的影響

JC423在各pH值條件下均可以生長,在偏酸和偏堿的條件下菌絲長勢和菌絲密度較中性條件下好,從菌絲長勢和菌絲密度來看,JC423菌絲更適宜偏堿環境,pH值為9～10時菌絲生長速度顯著好于其他處理(表2)。

2.5.6 不同溫度對菌絲生長的影響

溫度對菌絲生長影響差異顯著(表2),25 ℃條件下,菌絲濃密,生長速度最快,與其他處理差異極顯著。JC423在較低溫度下可以生長,但菌絲長勢不佳,生長速度慢。超過35 ℃菌絲不能生長。結合菌絲長勢和菌絲生長速度,確定25 ℃為JC423菌絲生長的最適宜溫度。

金針菇是一類重要的食藥用高等大型真菌,是我國最早進行人工栽培的食用菌之一,也是我國食用菌工廠化生產中規模最大、產量最高、發展最快和技術最成熟的栽培種類,產量穩居世界之首[27]。目前我國栽培的金針菇可以分為白色和黃色2種,白色品系有日本金針菇、F21、Fv088、金針菇SD-1、金白1號等。白色金針菇一般生育期較長、產量高,主要用于工廠化栽培。然而,我國金針菇生產對外依賴程度較大,種源大多來自日本和韓國,并且存在菌種退化、適應性差、變異大和性狀不穩定等種源問題[28]。黃色品系有雜交19、F135、三明1號、魯金針1號、金針913等。黃色金針菇生育期短,但子實體整齊度差,主要以農法栽培為主,工廠化栽培品種較少。我國亟需加強金針菇種質資源的開發、優良品種的選育和自主知識產權菌株推廣[29]。目前用于人工栽培的食用菌絕大多數是經由野生菌種馴化而來,野生菌種具有抗病性強、生物轉化率高等特點,將篩選出來的野生菌株不斷進行人工選擇,可逐漸培養為栽培種。我國選育的第一個金針菇優良菌種“三明1號”便是從全國28個野生菌株中選育而來。本研究分離獲得一個黃色金針菇菌株JC423,為金針菇的人工馴化提供了候選的菌種資源。

截至2021年7月,Species Fungorum索引顯示,全球分布的金針菇資源共有30條記錄,被認可的金針菇屬物種共計17個,包括金針菇F.filiformis、刺頭金針菇F.cephalariaePérez-Butrón &Fern.-Vic、芬娜金針菇F.fennaeBas、芬蘭金針菇F.finlandicaP.M.Wang et al.、毛腿金針菇F.velutipes(Curtis) Singer等[29]。金針菇屬野生子實體形態可塑性強,需要通過形態學和分子序列分析才能有效鑒定[30]。2015年之前公開報道的中國、日本和其他亞洲國家的金針菇被認為與產自歐洲的模式種“Flammulinavelutipes(Curtis) Singer”為同一種。2015年中國科學院昆明植物所真菌多樣性與分子進化研究團隊基于ITS序列的分子系統學研究認為,東亞的金針菇是歐洲金針菇的一個變種Flammulinavelutipesvar.filiformis[30]。而后2018年該團隊基于ITS序列、翻譯延伸因子1-α(tef1-α)、rpb2和homeodomain1 (HD1)的部分序列對來自東亞、歐洲和北美的81個金針菇菌種進行了系統發育研究和種屬劃分,結果顯示,從東亞馴化而來的金針菇與原初描述來自歐洲的F.velutipes是兩個不同的物種,并將金針菇命名為F.filiformis[31]。本研究分離獲得的JC423最初經BLAST比對,相似性最大的均為F.velutipes,撰寫本文之際重新進行了BLAST比對,并利用F.velutipes模式菌株進行進化樹構建,結果表明,JC423與模式菌株系在不同分支,非相同菌種,與中國河北的F.filiformisstrain F007聚為一支,從而進一步確認JC423為金針菇。

野生食用菌的馴化栽培,依賴于對菌種生物學特性的研究。本研究采用單因素試驗,研究了不同碳源、氮源、無機鹽、維生素、pH值和溫度對金針菇JC423菌絲生長的影響。試驗結果顯示,金針菇JC423適宜碳源為果糖,與已報道結果略有不同,如金針菇江山一號適宜氮源為面粉[32];最適氮源為蛋白胨,其次是酵母膏,可見有機氮對金針菇生長的促進作用優于無機氮。王德昌[33]研究也表明,黃豆粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉是很好的氮源,對菌絲生長的促進作用優于硝酸銨、硫酸銨等無機氮。JC423最適宜pH值為9～10,與一般文獻記載稍有差異,例如何俊等[29]研究表明,野生柳生金針菇和金針菇適宜pH值為6.0。JC423最適宜生長溫度為25 ℃,與李良等[34]的研究結果基本一致,其確定了金針菇白色菌株F21菌絲適宜生長溫度為25～27 ℃。無機鹽和維生素對金針菇菌絲生長影響不大。在無機鹽方面,何俊等[29]篩選出的金針菇最適無機鹽為硫酸鎂;楊云靜[32]認為,鉀離子和磷離子是金針菇菌絲生長必要的。本研究中添加的無機鹽對菌絲長勢和生長速度的影響差異不顯著。培養基中添加各種維生素后,與對照相比,菌絲更健壯更濃密,但在生長速度方面差異不顯著,與楊云靜[32]的研究結果基本一致。下一步應該以篩選的對菌絲生長影響較為顯著的碳源、氮源、pH值為直接因素進行正交試驗,以確定對JC423菌絲生長影響較大的因子,為野生金針菇種質資源開發利用,新品種選育提供一定的數據參考。