依洛尤單抗預處理對小鼠心梗后心衰的改善作用及其機制

任高彤,李甜甜,封仁乾,王 迪,蘇 瑞,亓秉超,張明明,李 妍*

(1空軍軍醫大學唐都醫院心內科,西安 710032;2空軍軍醫大學基礎醫學院;*通訊作者,E-mail:profleeyan@163.com)

心血管疾病在全球范圍內發病率一直居高不下,是全球疾病致死的首要原因,全球死亡患者中1/3死于心血管疾病,中國因心血管疾病死亡人數居世界第一位[1]?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2021》指出,城鄉居民疾病死亡構成比中,心血管疾病占據首位[2]。心力衰竭是大多數心血管疾病共有的終末期表現,心力衰竭位列成人中住院病因的首位,心衰患者5年生存率甚至低于前列腺癌患者和乳腺癌患者[3,4]。急性心肌梗死是近20年心力衰竭最常見的病因[5]。心肌梗死后心肌細胞凋亡和心肌纖維化是不良心肌重塑的重要病理特征,也是導致心力衰竭的主要原因[6,7]。隨著介入治療和藥物治療的不斷發展,心?；颊咦≡浩陂g和心梗后1年死亡率大大下降,但是心梗后心衰的發生率和死亡率依然很高[8-10]。探討心梗后心衰的發病機制,提出針對性的治療方法,對心梗后心衰的臨床治療具有重要意義。

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)可以介導低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受體的內吞并使其降解,減少肝細胞對低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的回收降解,導致循環中LDL-C含量升高[11-13]。PCSK9的單克隆抗體依洛尤單抗能夠使冠心病患者在應用他汀列類降脂藥物的基礎上進一步降低LDL-C達59%,使心血管不良事件下降13.7%[14]。隨著PCSK9研究進展,PCSK9作用于脂代謝以外的多效性也得到了越來越多的證據支持。PCSK9能夠結合心肌細胞、平滑肌細胞、內皮細胞等多種細胞類型,在心梗、動脈粥樣硬化等多個病理生理過程中發揮重要作用[15]。例如,心梗后心肌組織PCSK9表達水平升高,升高的PCSK9促進了心肌細胞的凋亡和自噬[16,17]。依洛尤單抗的臨床研究逐漸聚焦于急性心肌梗死患者等高危人群中依洛尤單抗用藥的啟用時機[18-20]。目前依洛尤單抗心梗前用藥的相關研究較少,因此,本研究旨在探討依洛尤單抗預處理對小鼠心梗后心衰的保護作用,并探討其可能的非脂代謝依賴的作用機制。

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級野生型雄性C57BL/6J小鼠和1～3日齡SD大鼠乳鼠購自空軍軍醫大學動物中心,所有小鼠均在恒溫恒濕動物房中飼養。所有動物實驗的設計和操作都嚴格遵守空軍軍醫大學發布的動物實驗手冊。

1.2 主要試劑及儀器

PCSK9一抗購自美國Abcam公司;Caspase-9一抗購自中國愛博泰克生物科技有限公司;β-actin一抗、SIRT3一抗、羊抗兔二抗購自中國三鷹生物技術有限公司;ABP、BNP引物購自中國生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司;RNAiso試劑盒、PrimeScript RT試劑盒、TB-green購自日本TAKARA公司;si-SIRT3購自中國擎科生物科技有限公司;TUNEL試劑盒購自美國Bio-Rad公司;Annexin Ⅴ-PE/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自中國索萊寶科技有限公司。酶標儀購自美國Thermo公司;RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司;蛋白印跡成像系統購自美國Bio-Rad公司;小鼠心臟功能超聲系統購自加拿大Visual Sonics公司;小鼠麻醉所用異氟烷購自中國一品制藥股份有限公司;鼠尾注射靜脈顯像儀購自中國卡爾文生物科技有限公司;依洛尤單抗溶液購自美國Amgen公司。

1.3 小鼠心肌梗死模型的建立和動物實驗分組

取6～8周齡的雄性C57BL/6J小鼠行心梗造模[21]。用異氟烷麻醉小鼠,于小鼠左側胸骨中線4～5肋間做一切口,將心臟從切口處擠出胸腔外,輕柔固定后于左心房下方1～2 mm處用6-0絲線行冠脈左前降支(LAD)結扎術,結扎后肉眼可見LAD支配區域心肌組織變白。心臟還納于胸腔后縫合切口,小鼠心電圖和小鼠心臟超聲均提示心梗模型建立成功。

C57BL/6J小鼠被隨機分為3組:假手術組(sham組)、心梗組(MI組)和心梗+依洛尤單抗預處理組(MI+Evolo組),每組小鼠51只。sham組小鼠行完全相同的手術流程但未結扎冠脈,MI組小鼠行心梗手術并結扎冠脈,MI+Evolo組小鼠行心梗手術并結扎冠脈,且在手術前4 h尾靜脈注射依洛尤單抗溶液[22]。小鼠尾靜脈注射依洛尤單抗的操作方法:將小鼠放入小鼠固定器,置于鼠尾注射靜脈顯像儀上,用50 μl注射器吸取依洛尤單抗溶液,于鼠尾中上段沿鼠尾靜脈斜行進針,輕柔推注依洛尤單抗溶液,靜脈腔內血液被溶液沖壓消失即為尾靜脈注射成功。依洛尤單抗用藥劑量為10 mg/kg體質量,給藥時間為手術前4 h[22]。

1.4 Western blot檢測PCSK9、SIRT3、cleaved Caspase-9的蛋白水平

用PBS清洗小鼠心肌組織3次,剪碎后用充分研磨。加入RIPA裂解液,充分裂解細胞,取上清液行BCA蛋白定量。蛋白提取全程于4 ℃低溫條件下進行。原代心肌細胞提取蛋白先用PBS輕柔沖洗細胞,隨后直接添加RIPA裂解液,后續步驟與組織提取蛋白相同。根據定量結果調整各樣本上樣體積,按照Western blot實驗流程進行操作,采用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白,轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉常溫封閉PVDF膜60 min,TBST溶液漂洗,4 ℃條件PCSK9一抗1∶1 000、SIRT3一抗1∶1 000、cleaved Caspase-9一抗1∶1 000孵育過夜。TBST溶液漂洗PVDF膜3次。室溫下羊抗兔二抗1∶5 000孵育60 min,TBST溶液漂洗PVDF膜3次。A液、B液體積1∶1配制發光液,用化學發光法檢測目的蛋白條帶,用蛋白印跡成像系統記錄條帶,以β-actin為內參蛋白進行目的蛋白定量分析。

1.5 qRT-PCR法檢測心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)的mRNA水平

按照TAKARA公司RNAiso試劑盒實驗操作流程,提取心肌組織和原代心肌細胞的總RNA,使用PrimeScript RT試劑盒行反轉錄獲取cDNA,最后用TB Green預混的TaqⅡ酶進行實時定量PCR。檢測小鼠心梗后7,14,28 d心肌組織ANP、BNP的mRNA水平;檢測缺氧處理3,6,9 h原代心肌細胞ANP、BNP的mRNA水平。RT-PCR儀設定的循環參數如下:95 ℃ 30 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環40次。以β-actin為內參進行相對定量分析。

1.6 超聲心動圖檢查

超聲心動圖檢查前24 h,將小鼠胸前區域脫毛。用異氟烷持續吸入麻醉小鼠,將小鼠放置于恒溫操作板上,超聲探頭置于小鼠胸骨旁長軸切面,獲取M型超聲心動圖。用超聲心動儀配套軟件測算左心室射血分數、左心室短軸縮短率、左心室內徑。

1.7 心肌梗死及心肌細胞的凋亡檢測

心梗造模后7,14,28 d,分別在sham組、MI組和MI+Evolo組中隨機選取8只小鼠行心臟取材。用異氟烷麻醉小鼠,脫頸法處死,隨后開胸取心臟。將小鼠心臟用4%甲醛固定過夜,常規石蠟包埋,切片厚5 μm。心梗后7 d的心臟切片行TUNEL染色以觀察心肌細胞的凋亡情況,心梗后14,28 d的心臟切片行Masson染色以觀察心肌梗死面積。染色封片后使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察并拍照,用Image J軟件進行定量分析。

1.8 小鼠心室肌組織轉錄組測序

心梗建模后3 d,分別在sham組、MI組和MI+Evolo組中隨機選取3只小鼠,取各小鼠心室肌組織,Trizol法提取小鼠心室肌總RNA,進行質量控制,檢測RNA完整性,富集mRNA。使用美國Illumina生物技術公司RNA-seq樣本制備試劑盒(mRNA-Seq sample preparation kit),嚴格按照試劑盒說明書構建cDNA文庫。進行Illumina Novaseq 6000、PE150測序,對照小鼠的基因組信息和完整的轉錄組信息,將測序出的reads進行注釋、定量和分析。

1.9 原代心肌細胞的分離、培養和細胞實驗分組

將1～3日齡SD大鼠乳鼠在75%酒精中充分浸泡,乳鼠體表消毒后置于細胞實驗室超凈臺內,摘取乳鼠心臟,置于無菌PBS中,清洗血液,充分剪碎乳鼠心臟,置于無菌玻璃瓶中。加入1 mg/ml的Ⅰ型膠原酶5 ml,移液槍輕柔吹打混勻剪碎的心肌組織,用高壓滅菌過的瓶蓋密封玻璃瓶,在37 ℃孵箱中消化心肌組織5 min,輕柔吸取上層消化液,加入盛有含10%胎牛血清DMEM培養基的5 ml離心管中以終止消化。重復消化5～6次直至心肌組織消化完畢。收集消化后所得細胞混懸液,800 r/min室溫下離心5 min,棄上清后所得沉淀即為原代心肌細胞和成纖維細胞。用添加10%胎牛血清的DMEM培養基重懸沉淀后種植于小培養瓶,37 ℃孵箱中靜置2 h,使成纖維細胞貼壁,此時原代心肌細胞未貼壁而處于懸浮狀態。最后,將小培養瓶中的培養基轉移至6孔板培養48 h,原代心肌細胞即可充分貼壁。

原代心肌細胞分為4組:對照組(Con組)、缺氧組(hypoxia組)、缺氧+依洛尤單抗預處理組(hypoxia+Evolo組)和缺氧+依洛尤單抗預處理+SIRT3干擾組(hypoxia+Evolo+si-SIRT3組)。Con組細胞未進行任何處理;缺氧組細胞置于缺氧細胞培養箱中缺氧3 h;hypoxia+Evolo組細胞缺氧前5 min培養基中添加依洛尤單抗溶液,給藥濃度為100 μg/ml[22],隨后將細胞置于缺氧細胞培養箱中缺氧3 h;hypoxia+Evolo+si-SIRT3組細胞缺氧前48 h用si-RNA轉染原代心肌細胞并在缺氧前5 min培養基中添加依洛尤單抗溶液,隨后將細胞置于缺氧細胞培養箱中缺氧3 h。細胞實驗每組3個樣本。si-RNA轉染原代心肌細胞的操作方法:取貼壁的原代心肌細胞。提前準備2個試管,1個試管的培養基中包含si-RNA轉染試劑LipofectamineTMRNAiMAX,另1個試管的培養基中包含si-RNA,將兩個試管內容物輕柔混合均勻,在室溫下孵育5 min,隨后進行細胞轉染。si-RNA共轉染48 h,其后可行細胞干預。

1.10 流式細胞術檢測原代心肌細胞凋亡

使用胰酶將貼壁的原代心肌細胞消化至細胞懸液,等體積細胞培養基中和胰酶,離心獲得細胞團塊。PBS重懸細胞,使用Annexin Ⅴ-PE/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒,嚴格按照試劑盒說明書操作流程染色,用流式細胞儀獲得數據并定量分析。

1.11 統計學分析

看完信，阿強覺得好笑，以為是誰的惡作劇，但也沒有掉以輕心，出門進門都小心翼翼。三天過去了，家里一樣東西也沒有少，阿強逐漸放松了警惕。第四天，阿強在家休息，忽然聽到一個女子的驚叫聲從門外傳來：“來人呀，快抓流氓呀！”

2.1 心梗后小鼠心肌組織中PCSK9,SIRT3,ANP,BNP水平變化

心梗后7,14,28 d小鼠心肌組織中PCSK9表達水平明顯升高,SIRT3表達水平明顯下降(均P<0.05,圖1)。心梗后14 d PCSK9表達增加最為顯著,心梗后28 d PCSK9表達水平相較心梗后14 d有所下降。與sham組相比,MI組小鼠心肌組織中ANP、BNP mRNA水平均升高(P<0.05,見圖1)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 缺氧處理的原代心肌細胞中PCSK9,SIRT3,ANP,BNP水平變化

在缺氧處理3,6,9 h的原代心肌細胞中,PCSK9表達水平明顯升高,SIRT3表達水平明顯下降(P<0.05,見圖2),與心梗后小鼠心肌組織中PCSK9、SIRT3表達變化情況保持一致。缺氧處理組原代心肌細胞中ANP、BNP mRNA水平明顯高于Con組(P<0.05,見圖2)。

與Con組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 依洛尤單抗預處理改善小鼠心梗后心臟收縮功能

心梗后28 d,超聲結果顯示MI組小鼠心臟收縮功能明顯下降,表現為MI組小鼠左心室射血分數、短軸縮短率低于sham組(P<0.05),收縮期左室內徑高于sham組(P<0.05,見圖3)。相比于MI組,MI+Evolo組小鼠心臟收縮功能有所改善,表現為MI+Evolo組小鼠左心室射血分數、短軸縮短率高于MI組(P<0.05,圖3),收縮期左室內徑低于MI組小鼠(P<0.05,見圖3)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 依洛尤單抗預處理減少小鼠心梗后心臟梗死面積

心梗后14,28 d,Masson染色結果顯示MI組小鼠心臟梗死面積明顯高于sham組小鼠(P<0.05);而相比于MI組,MI+Evolo組小鼠心臟梗死面積明顯下降(P<0.05,見圖4)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.5 轉錄組測序結果中SIRT家族轉錄水平變化

分析轉錄組測序結果,Sirtuins家族中可見SIRT3、SIRT5、SIRT7在sham組和MI組之間的轉錄水平發生明顯變化,其中,只有SIRT3在MI組和MI+Evolo組之間的差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

與sham組比較,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05

2.6 依洛尤單抗預處理減少心梗小鼠心肌細胞凋亡

心梗后7 d,TUNEL檢測結果顯示,MI組小鼠心肌細胞凋亡相較于sham組明顯增加,具體表現為心梗小鼠心肌組織TUENL染色細胞核陽性率升高(P<0.05,見圖6)。依洛尤單抗預處理降低了心肌細胞的凋亡水平,具體表現為小鼠心肌組織TUENL染色細胞核陽性率下調(P<0.05,見圖6)。

圖6 依洛尤單抗預處理減少心梗小鼠心肌細胞凋亡(n=8)

2.7 依洛尤單抗預處理通過上調SIRT3水平減少心梗小鼠心肌細胞凋亡

心梗后7 d的Western blot結果顯示,相較于sham組,MI組小鼠心肌組織中PCSK9表達明顯升高,SIRT3表達明顯降低,cleaved Caspase-9表達明顯升高,提示MI組小鼠心肌細胞凋亡增加。依洛尤單抗預處理下調了心梗小鼠心肌組織中PCSK9的表達量,上調了SIRT3的表達量,并降低了心肌細胞的凋亡水平,具體表現為cleaved Caspase-9水平下降(P<0.05,見圖7)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.8 依洛尤單抗預處理通過上調SIRT3水平減少缺氧處理的原代心肌細胞凋亡

缺氧處理3 h,原代心肌細胞Western blot結果和流式細胞儀檢測結果顯示,與Con組相比,缺氧組原代心肌細胞的PCSK9表達明顯升高,SIRT3表達明顯下降,cleaved Caspase-9表達明顯升高且心肌細胞凋亡率明顯上升(P<0.05,見圖8),提示缺氧組原代心肌細胞凋亡增加。依洛尤單抗預處理下調了缺氧處理的原代心肌細胞中PCSK9表達量,上調了SIRT3表達量,并降低了原代心肌細胞的凋亡水平,具體表現為cleaved Caspase-9表達下調、心肌細胞凋亡率下降(P<0.05,見圖8)。

2.9 si-SIRT3可逆轉依洛尤單抗預處理對缺氧原代心肌細胞凋亡的抑制作用

為了驗證依洛尤單抗是否通過SIRT3改善心梗小鼠心臟收縮功能,本研究分離原代心肌細胞并用si-SIRT3干擾SIRT3的表達進行了體外細胞實驗。原代心肌細胞缺氧處理3 h,結果顯示,相比于Con組,缺氧組原代心肌細胞中PCSK9表達上升,SIRT3表達下降,cleaved Caspase-9表達升高(P<0.05,見圖9),提示缺氧引起原代心肌細胞凋亡增加。依洛尤單抗預處理明顯下調了缺氧處理的原代心肌細胞中PCSK9表達量,上調了SIRT3表達量,減少了缺氧引起的原代心肌細胞凋亡(P<0.05,見圖9)。相較于hypoxia+Evolo組,hypoxia+Evolo+si-SIRT3組原代心肌細胞PCSK9表達量未見明顯變化,SIRT3表達量明顯降低,同時cleaved Caspase-9表達升高(P<0.05,見圖9)。結果表明,si-SIRT3可以逆轉依洛尤單抗預處理對缺氧原代心肌細胞凋亡的抑制作用。

與Con組比較,**P<0.01;與缺氧組比較,##P<0.01;與hypoxia+Evolo組比較,&&P<0.01

心肌梗死發生后,冠脈血流的突然中斷或減少引起心肌細胞死亡或功能障礙[23]。心肌梗死后心肌細胞凋亡和心肌纖維化是不良心肌重塑的重要病理特征,也是導致心力衰竭的主要原因[6,7]。心肌梗死后心力衰竭以缺氧引起心肌細胞死亡和存活心肌細胞出現功能障礙為主要特征[23,24]。因此,本研究聚焦于減少心梗后心肌細胞凋亡和改善心梗后心臟收縮功能,針對性提出了治療方案。

近年來研究表明,PCSK9具備不依賴于LDL受體的多效性作用,相應的,PCSK9單抗同樣具備降脂作用以外的多效性。PCSK9單抗能夠改善血管內皮功能、緩解血管壁炎癥、減少心梗后梗死面積[22,25,26]。本研究首先明確了小鼠心梗后心肌組織中PCSK9表達情況,發現心梗后小鼠心肌組織中PCSK9蛋白表達明顯增加。據此,本研究采用臨床廣泛應用的依洛尤單抗行小鼠心梗前預處理,以探討依洛尤單抗對心梗小鼠心肌組織中PCSK9表達的作用,以及對心梗小鼠心臟功能和心臟梗死面積的作用。實驗結果顯示,依洛尤單抗預處理后,心梗小鼠心肌組織中PCSK9蛋白表達下調,心臟收縮功能改善,心臟梗死面積減小。該結果與既往研究保持一致[17,22]。

依洛尤單抗預處理對小鼠心梗后心衰改善作用的具體機制尚未完全清楚,本研究取小鼠心室肌組織行轉錄組測序發現,MI組相較于sham組,Sirtuins家族中可見SIRT3、SIRT5、SIRT7的轉錄水平發生明顯變化,其中,只有SIRT3在MI組和MI+Evolo組兩組之間的差異具有統計學意義。以sham組小鼠為參照,MI組和MI+Evolo組小鼠心肌組織中SIRT3表達均下調,但是,MI+Evolo組小鼠比MI組小鼠心肌組織中SIRT3下降幅度小,SIRT3表達量為MI組的2倍左右,提示依洛尤單抗預處理對心梗小鼠心臟收縮功能的改善作用可能為SIRT3依賴的。

Sirtuins家族為NAD依賴性的組蛋白去乙?；?屬于第三類組蛋白去乙?；?在調節細胞代謝、轉導胞內信號、衰老等眾多生理過程中發揮重要作用。SIRT3定位于線粒體膜上,通過對賴氨酸可逆性去乙?；?廣泛參與線粒體功能、生物合成、糖代謝、脂代謝、氧化應激和凋亡等多種生理過程的調節[27]。既往研究表明,SIRT3與細胞凋亡密切相關。SIRT3通過作用于超氧化物歧化酶2(SOD2)、異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)等底物顯著增強細胞清除胞內ROS的能力[28,29],并通過作用于Opa1、Ku70、環孢素D等底物抑制細胞凋亡[30-32]。此外,在心衰的發病過程中,SIRT3也發揮著重要作用。心衰小鼠心肌組織中SIRT3表達水平下降[33]。上調SIRT3可通過抑制TGF-β/Smad3信號通路而抑制心肌纖維化,延緩心臟重塑,改善心臟功能[34]。近年來,SIRT3被視為心衰治療的重要靶點[35]。本研究結果顯示,心梗小鼠心肌組織中SIRT3蛋白表達下降,心肌細胞凋亡增加。依洛尤單抗預處理上調了心梗小鼠心肌組織中SIRT3表達水平,并降低了心梗小鼠心肌細胞凋亡水平。原代心肌細胞缺氧前給予依洛尤單抗預處理,上調了缺氧原代心肌細胞中SIRT3的表達量,緩解了缺氧誘導的原代心肌細胞凋亡。為了明確依洛尤單抗預處理對小鼠心梗后收縮功能的改善是否通過SIRT3而發揮作用,在體外原代心肌細胞實驗中,用si-SIRT3抑制原代心肌細胞SIRT3蛋白表達后,再行原代心肌細胞缺氧前依洛尤單抗預處理。實驗結果顯示,抑制原代心肌細胞SIRT3蛋白表達后,逆轉了依洛尤單抗預處理減少缺氧原代心肌細胞凋亡的作用。

本研究存在一定的局限性。其一,心梗后心衰的病理生理機制十分復雜,依洛尤單抗預處理可能通過作用于其他分子發揮其心梗后心功能改善作用,但至少在本研究中證實其部分作用是通過激活SIRT3發揮的;其二,依洛尤單抗預處理通過何種方式上調SIRT3表達及其具體的分子調控機制尚未明確,課題組正在進行相關研究。

總而言之,本研究證明,依洛尤單抗在心梗手術前預處理可以改善小鼠心梗后心臟收縮功能,降低小鼠心梗后心臟梗死面積,并通過轉錄組測序發現了新的作用機制,依洛尤單抗預處理對小鼠心梗后心衰的緩解作用很可能是通過激活SIRT3表達、降低心肌細胞凋亡水平而發揮的。本研究為臨床急性心?；颊邞靡缆逵葐慰沟陌踩院陀行蕴峁┝藢嶒炞C據,也為臨床急性心?；颊咴缙趩⒂靡缆逵葐慰固峁┝藢嶒瀰⒄?。