褪黑素對荻種子萌發及幼苗生長和生理的影響

梁宇鵬，張 杰，梁曉寧，謝思敏

（1.安徽師范大學 生態與環境學院，安徽 蕪湖 241002；
2.安徽省重要生物資源保護與利用研究重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

褪黑素（melatonin，MT），又名N-乙?；?5甲氧基色胺，是一種吲哚雜環類化合物，先后在人和動物體內被發現，起到自由基清除劑和抗氧化劑的作用，可以減少機體受到的氧化損傷，且人體內的褪黑素還有調節人體的晝夜節律、延緩人體器官衰老、增強人體免疫力等作用［1］。1995年褪黑素首次在植物體內被發現，被證明能夠提高愈傷組織的再生能力，影響種子萌發和植株開花時間，促進不定根的生長，延緩葉片衰老等［2］。褪黑素含有的5-甲氧基官能團和N-乙?；Y構表明其自身具有高親脂性、親水性以及與受體結合的特異性［3］，可以通過生物膜發揮調節作用。此外，作為合成前體與生長素相同的植物激素，褪黑素在低濃度情況下可以促進植物根和幼葉的生長，褪黑素處理過的植株可以表現出更穩定的碳代謝和氮代謝水平［4］。

荻［Miscanthus sacchariflorus（Maxim.）Benth.］作為一種C4型能源植物，屬于禾本科芒屬，光合效率高，營養需求低，水分利用效率高，一直被認為是一種潛在的高產生物質作物［5］，對環境的適應性強，可以在貧瘠或脅迫條件下生長，主要分布在河流流域、湖畔灘、沿海海灣和內陸低洼區，是我國固堤防土的環保型植物，也是改良重金屬污染土壤和尾礦廢棄地的首選物種［6-7］。一方面，荻可以作為原材料，在科學方法的處理下提供生物質能；
另一方面，荻具有能源植物的生長快、抗性強、生物量大等特點，在修復污染土壤方面具有一定的社會效益、經濟效益和生態效益。Aleksandra等［8］發現在不良環境下，荻的干物質含量比奇崗（Miscanthus×giganteus）等其他三種C4草本植物都高。此外，在鎘脅迫、鹽堿脅迫、重金屬復合脅迫等逆境條件下，種植荻對土壤修復都具有重要作用［9-11］。

種子可以通過將植物胚保存在干燥和高度抵抗的狀態來促進植物傳播，其結構復雜［12］。成熟的種子在吸水膨脹后恢復代謝，標志著種子開始萌發，這一過程是高等植物生命周期中至關重要的發育階段［13］，涉及一系列受內外調控的生化事件，如植物激素水平、溫度和光照射。近年來越來越多的研究發現，褪黑素作為一種植物激素，對逆境脅迫下的植物有一定的緩解作用，在非生物脅迫下，褪黑素對植物種子萌發有一定的影響［14-16］，但是目前關于無脅迫條件下褪黑素對植物種子影響的研究較少。本研究以荻為實驗材料，旨在研究褪黑素浸種對無脅迫條件下荻種子萌發的影響，通過對萌發指標、生長指標、葉綠素含量、脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、抗氧化酶活性和電導率等生理指標的測定和分析，得到對荻種子萌發有促進作用的最優褪黑素濃度，為獲得更好的荻生長條件提供研究基礎。

1.1 實驗材料

供試種子于2021年12月14日采自安徽師范大學花津校區山坡，將采集到的荻穗于陽光下晾曬減少自由水后，剝離穎殼并保留顆粒飽滿的種子，凍存于4℃冰箱，用于實驗使用。褪黑素試劑購于麥克林官網（CAS：73-31-4），設置的褪黑素濃度分別是1、10、50、100、500μM，蒸餾水處理為對照組，記為CK。每個處理組設置6個重復。

1.2 實驗設計

萌發實驗開始于2022年4月16日，將顆粒飽滿的荻種子分成6份，用3%的NaClO消毒10min后，用蒸餾水沖洗5~6遍直至干凈，用不同的褪黑素溶液或蒸餾水浸種24h（黑暗條件，28℃）。浸種完成后再次用蒸餾水沖洗荻種子表面的褪黑素溶液，直至干凈。選用8.5cm的培養皿，鋪上兩層濾紙，加4mL蒸餾水，不同處理組的培養皿均勻擺放100粒對應處理下的荻種子，以10×10方陣排列。統一放入光照培養箱中，晝夜的光暗比為14h/10h，溫度分別是28℃和26℃。培養期間，定時加入定量蒸餾水，確保荻種子的正常生長。

1.3 測定指標及計算方法

1.3.1 萌發指標的測定以根長超過種子長或芽長超過種子的一半長度作為種子的發芽標準，在荻種子萌發后，每天的同一時間進行荻種子萌發數目的統計，計數7天后，根據下列公式分別計算荻種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數［7］。

發芽勢（%）=（前4天萌發的種子總數/實驗種子數）×100%；
發芽率（%）=（前7天萌發的種子總數/實驗種子數）×100%；
發芽指數=ΣGt/Dt（Gt為第t天的發芽增值數，Dt為相應的發芽天數）；
活力指數=種子發芽指數×苗高。

1.3.2 生長指標的測定待萌發第12天，用精度0.01mm的鋼尺測量荻幼苗的根長和苗高，用精準天平測量幼苗的鮮重。

1.3.3 生理生化指標的測定待發芽第4天取樣，用氫氧化鈉滴定法測脂肪酶活性，用3，5-二硝基水楊酸比色法測定淀粉酶活性［17］，用福林酚法測定蛋白酶［18］；
待發芽第14天取樣測葉綠素含量［19］、相對電導率［20］、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性［21］。

1.4 數據處理與分析

數據處理SPSS 19.0軟件，使用ANOVA進行分析，作圖軟件采用Excel 2016。

2.1 褪黑素處理對荻種子萌發指標的影響

由表1可知，褪黑素對荻種子發芽勢的影響顯示了“低促高抑”的作用效果。隨著褪黑素濃度的升高，荻種子的發芽勢逐漸提高，當褪黑素濃度為50μM時，荻種子的發芽勢達到最大，是對照組的1.03倍。在褪黑素濃度為500μM的時候，荻種子的發芽勢受到抑制，是對照組的0.99倍。由表1可以看出，褪黑素對荻種子的發芽率、發芽指數和活力指數都具有促進作用，且隨著褪黑素濃度的升高，荻種子的發芽率、發芽指數、活力指數都呈上升的趨勢。當褪黑素濃度超過50μM時，褪黑素對荻種子的發芽率、發芽指數、活力指數的促進作用減弱?？傮w上看，當褪黑素濃度為50μM時，褪黑素對荻種子萌發的促進作用最好，此時的發芽率、發芽指數、活力指數分別是對照組的1.04、1.09、1.16倍，均與對照組之間存在顯著差異。

2.2 褪黑素處理對荻幼苗生長指標的影響

由表2可知，不同濃度的褪黑素處理下的根長與對照組相比，分別是對照組荻幼苗根長的1.12、1.91、1.07、0.90、0.99倍，說明褪黑素作用于荻幼苗的根部時，低濃度褪黑素可以促進荻幼苗根部生長，高濃度褪黑素抑制荻幼苗的根部生長。其中，10μM的褪黑素處理下的幼苗根部長的最好，與100μM、500μM的褪黑素處理下的幼苗根長有顯著差異，說明不同濃度的褪黑素處理對荻幼苗根部有明顯差異性的作用。不同濃度褪黑素處理下的荻幼苗的苗高、鮮重相對于對照組都是增大的，其苗高分別是 對 照 組 的1.02、1.05、1.07、1.01、1.005倍，其鮮重分別是對照組的1.08、1.13、1.07、1.03、1.10倍。其中，10μM和50μM褪黑素處理下的幼苗的苗高與對照組之間均存在顯著差異，說明不同濃度的褪黑素對荻幼苗的苗高有顯著不同的作用。除了500μM的褪黑素以外，褪黑素處理濃度升高至10μM，荻幼苗的鮮重呈現增加趨勢；
隨著處理濃度的繼續升高，褪黑素對荻幼苗的鮮重的促進作用減弱。

表2 褪黑素處理對荻幼苗生長指標的影響Table 2 Effects of melatonin treatment on growth index of the seedlings of M.sacchariflorus

2.3 褪黑素處理對荻幼苗生理生化指標的影響

由圖1可以看出，褪黑素對荻種子的α-淀粉酶活性有促進作用（除500μM褪黑素會降低α-淀粉酶活性），不同處理組的α-淀粉酶活性分別是對照組的1.01、1.18、1.18、1.22、0.88倍。其中，100μM、500μM褪黑素處理下的α-淀粉酶活性與對照組之間均存在顯著差異，說明該濃度的褪黑素對荻種子的α-淀粉酶活性有增強或減弱的作用。但是僅10μM的褪黑素濃度對荻種子的總淀粉酶活性有促進作用，其余四個濃度的褪黑素均會不同程度的降低總淀粉酶活性，且不同濃度褪黑素對荻種子的總淀粉酶活性的影響相對于對照組來說均沒有顯著性差異（P＞0.05）。10μM褪黑素處理下的總淀粉酶活性與1μM和500μM褪黑素處理的結果之間均存在顯著性差異，說明不同濃度褪黑素處理對于荻種子的總淀粉酶活性有不同的作用效果。

圖1 褪黑素處理對荻種子淀粉酶活性的影響Fig.1 Effects of melatonin treatment on amylase activity of the seeds of M.sacchariflorus

由圖2可以看出，不同濃度褪黑素處理的荻種子脂肪酶活性相較于對照組都是升高的，分別是對照組的1.75、3.63、3.31、2.06、1.94倍，其中，10μM、50μM褪黑素作用的效果最好，與對照組之間存在顯著差異。而1μM、100μM和500μM褪黑素處理下的荻種子的脂肪酶活性與對照組之間不存在顯著性，說明一定濃度的褪黑素對荻種子的脂肪酶活性有促進作用，高濃度褪黑素的作用效果會降低。

圖2 褪黑素處理對荻種子脂肪酶活性的影響Fig.2 Effects of melatonin treatment on lipase activity of the seeds of M.sacchariflorus

由圖3可以看出，褪黑素處理下的荻種子的蛋白酶活性相較于對照組均減弱，分別是對照組的0.26、0.86、0.67、0.59、0.68倍。除10μM以外，其他濃度的褪黑素處理均對蛋白酶活性有明顯的抑制作用。其中，1μM褪黑素對荻種子的蛋白酶活性抑制效果最顯著，而10μM、50μM、100μM、500μM褪黑素處理之間沒有顯著差異。

圖3 褪黑素處理對荻種子蛋白酶活性的影響Fig.3 Effects of melatonin treatment on protease activity of the seeds of M.sacchariflorus

由表3可以看出，不同濃度褪黑素處理下的葉綠素a含量分別是對照組的1.04、1.19、1.06、1.11、1.04倍，10μM褪黑素處理下的葉綠素a含量與其他處理組（100μM除外）之間均存在顯著差異；
其葉綠素b含量分別是對照組的1.05、1.12、1.04、1.06、0.97倍，500μM的高濃度褪黑素會抑制葉綠素b的產生；
其胡蘿卜素含量分別是對照組的1.25、1.43、1.32、1.26、1.25倍，與對照組之間均存在顯著差異?？傮w上看，10μM褪黑素對葉綠素含量的作用效果最好，與對照組之間均存在顯著性差異，但是不同濃度的褪黑素對葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的作用效果不同。

表3 褪黑素處理對荻幼苗光合色素的影響Table 3 Effects of melatonin treatment on photosynthetic pigments in the seedlings of M.sacchariflorus

由圖4可知，不同濃度的褪黑素處理均能提高荻幼苗體內的SOD活性，分別是對照組的1.04、1.17、1.03、1.06、1.12倍。除50μM處理組之外，其他濃度褪黑素處理組與對照組之間均存在顯著性差異（P＜0.05），其中，10μM褪黑素處理下的荻幼苗體內的SOD活性最強，且與其他各處理組之間均存在顯著性差異。

圖4 褪黑素處理對荻幼苗SOD活性的影響Fig.4 Effects of melatonin treatment on SOD activity of the seedlings of M.sacchariflorus

由圖5可知，在一定范圍內，不同濃度褪黑素處理均可以提高荻幼苗體內的POD活性，分別是對照組的POD活性的1.09、1.25、1.54、1.05、1.11倍。10μM、50μM的褪黑素處理下荻幼苗的POD活性與對照組之間均存在顯著性差異，說明本實驗中10μM和50μM褪黑素對荻幼苗的POD有影響，且50μM褪黑素處理下荻幼苗的POD活性與其他處理組之間均存在顯著性差異，說明50μM褪黑素處理能夠最好的提高荻幼苗的POD活性。

圖5 褪黑素處理對荻幼苗POD活性的影響Fig.5 Effects of melatonin treatment on POD activity of the seedlings of M.sacchariflorus

由圖6可知，低濃度的褪黑素處理對荻幼苗的CAT活性有促進作用，但是高濃度的褪黑素會表現出抑制作用，各處理組的CAT活性分別是對照組的1.12、1.54、1.21、0.58、0.55倍。隨著褪黑素濃度的升高，CAT活性逐漸增強，直至褪黑素濃度為10μM時，CAT活性達到最大；
隨著褪黑素濃度繼續升高至50μM，褪黑素對荻幼苗CAT活性的增強效果減弱；
當褪黑素濃度達到并超過100μM時，荻幼苗體內的CAT活性減弱。

圖6 褪黑素處理對荻幼苗CAT活性的影響Fig.6 Effects of melatonin treatment on CAT activity of the seedlings of M.sacchariflous

由圖7可以看出，不同濃度的褪黑素處理下的相對電導率分別是對照組的0.89、0.81、0.74、0.87、0.87倍，說明不同處理對細胞損傷程度相對于對照組來說都有所降低，褪黑素能一定程度的緩解外界環境對細胞破壞的程度。其中，50μM褪黑素處理下的荻幼苗的相對電導率與對照組之間存在顯著差異，說明50μM褪黑素可以顯著減緩細胞被破壞的程度。

圖7 褪黑素處理對荻幼苗相對電導率的影響Fig.7 Effects of melatonin treatment on relative conductivity of the seedlings of M.sacchariflorus

種子萌發過程作為植物生命周期中的一個重要階段，其萌發指標、生長指標、生理指標等可以反映植物種子的生長情況。通過本實驗萌發指標的數據結果可以發現：隨著褪黑素濃度的升高，荻種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數逐漸升高，當褪黑素濃度為50μM時，荻種子萌發的促進效果最好，這一結果與Wen等［22］的研究結果一致。發芽指數可以表示發芽速度［23］，隨著濃度的升高，發芽指數越大，說明該處理下的種子萌發的越快，本實驗與Xiao等［24］的實驗結果一致，發現低濃度的褪黑素對荻種子的萌發指數有明顯的促進效果。Cao等［25］的研究結果表明褪黑素浸種處理下的玉米（Zea maysL.）種子的發芽勢和發芽率均比對照組高，但是不存在顯著性差異。而本實驗中，不同處理組的發芽勢不存在顯著差異，但50μM褪黑素處理下的發芽率存在顯著差異，可能是因為褪黑素在種子萌發的前期發揮的調節作用較小，隨著萌發天數的增加，不同物種的種子體內的物質種類和含量不同，導致褪黑素對不同物種的種子的信號調節也有所不同，從而呈現出不同的萌發效果。

種子萌發過程需要有足夠的營養物質提供，主要來自單子葉植物的胚乳。隨著種子的萌發，植物進行呼吸作用，消耗干物質，因此淀粉酶活力增強，將淀粉水解成單糖［26］，為植物生長提供能量。Bai等［27］經過實驗發現施加外源褪黑素可以促進淀粉水解和種子呼吸，從而提高棉花種子萌發和幼苗生長。10μM褪黑素處理下的荻種子體內α-淀粉酶和總淀粉酶活性均是最高，對荻幼苗的根長、鮮重的作用效果最好，說明此褪黑素濃度有利于荻種子的萌發和幼苗的生長。而Li等［28］發現施加200μM褪黑素可以提高鎘脅迫下的二色補血草（Limonium bicolor）種子的淀粉酶含量，促進種子萌發。說明不同植物需要褪黑素的處理濃度不同，需要進行針對性實驗設計。蛋白酶在細胞中可以調節蛋白質的循環和降解，將蛋白質水解成氨基酸和肽，提高生物利用率［29］，但本實驗發現褪黑素處理下的荻種子體內的蛋白酶活性均低于對照組，但是脂肪酶活性和低濃度褪黑素處理下的淀粉酶活性高于對照組，說明不同植物種子萌發階段消耗不同的酶的種類，而荻種子在萌發階段主要通過淀粉酶和脂肪酶提供萌發必需的營養物質。

淀粉酶可以將荻種子胚芽中的淀粉水解成單糖，隨著種子的萌發，胚芽中的營養物質逐漸被消耗，此時荻幼苗需要更多的能量物質。在這一過程中，葉片吸收光能，通過光合作用將CO2等無機物質轉化成糖類有機化合物。其中類胡蘿卜素作為輔助色素，將收集到的光能傳遞給葉綠素a和葉綠素b等主要色素，由葉綠素參與光化學反應，提供氧化還原反應的化學能。本實驗中，10μM褪黑素處理下的胡蘿卜素含量最高，說明該處理組的幼苗收集光能的能力更強。此外，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均是最高，說明該處理組的幼苗將光能轉化成化學能的能力最強。

植物在不受到外界脅迫條件的情況下，自身也含有一定量的活性氧?；钚匝鹾窟^多時，會導致質膜選擇透過性因膜脂過氧化而改變或喪失，破壞膜結構，打破細胞的滲透平衡［30］。本實驗發現，10μM和50μM褪黑素處理下的荻幼苗的電導率較小，即其質膜損傷程度較低，且與對照組之間存在顯著差異。且SOD、POD、CAT作為常見的抗氧化劑，其中SOD作為一類金屬酶，可以清除超氧陰離子自由基，減弱連鎖反應造成的生物損傷［31-32］；
POD可以催化H2O2氧化抗壞血酸等還原性物質，清除H2O2、保護酶蛋白、促進植物細胞木質素的形成等。龍國輝等［33］也發現POD可以通過調節木質素的合成，促進植物細胞的次生壁增厚，從而達到保護細胞的目的；
而CAT可促使H2O2分解成分子氧和水［34］。本實驗的結果顯示在低濃度褪黑素處理下（10μM和50μM），SOD、POD和CAT的含量都有所升高，10μM褪黑素處理下的抗氧化酶分別是對照組的1.17、1.25、1.54倍，均存在顯著差異，50μM褪黑素處理下的抗氧化酶分別是對照組的1.03、1.54、1.21倍。此時荻幼苗體內的抗氧化能力增強，清除活性氧的能力增強，從而降低質膜的膜脂過氧化的程度。說明低濃度的褪黑素能夠通過調節抗氧化酶活性調節膜脂過氧化程度，從而促進荻種子的萌發指標和幼苗的生長指標的提高。但是隨著處理濃度的升高，待褪黑素濃度超過一適宜值之后，會對植物產生毒害作用，減弱抗氧化酶活性，褪黑素的促進效果減弱或對荻種子和幼苗有抑制作用。在褪黑素濃度≥50μM時，SOD活性隨著褪黑素濃度的升高而升高，推測可能是在高濃度褪黑素下，超氧根陰離子通過哈伯·韋斯反應，在Fe2+/Cu2+的條件下生成羥自由基，減弱SOD將超氧根陰離子催化成H2O2。

褪黑素作為一種植物激素，且與生長素的合成前體一樣，都是色氨酸，因此具有與生長素類似的性質，例如可以促進植物生長。本實驗設置的褪黑素處理濃度中，10μM和50μM褪黑素對萌發指標、生長指標和生理指標的促進效果最好，對荻種子萌發和幼苗生長最有利。其中10μM褪黑素對荻幼苗的根長、苗高、鮮重有促進作用。在陳莉等［35］的實驗中發現10μM褪黑素對棉花幼苗的生物量和胚根長的效果較好，這與本實驗得到的結果一致，說明10μM褪黑素可以促進植物種子的萌發及幼苗的生長。

（1）低濃度的褪黑素可以促進荻種子萌發和生長，高濃度的褪黑素抑制荻種子的萌發和生長或促進效果減弱。其中，10μM和50μM褪黑素對荻種子萌發和荻種子的促進效果較好，10μM褪黑素的綜合促進效果最好，可以用于后續研究在一定濃度下的褪黑素對重金屬脅迫下的荻幼苗的緩解作用。

（2）在10μM或50μM褪黑素處理下，荻種子的淀粉酶、脂肪酶活性升高，荻幼苗的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量最高，抗氧化酶活性最強，細胞的質膜損傷程度最小。這些數據從植物生理方面解釋了在一定濃度褪黑素處理下，荻種子的萌發情況和幼苗的生長情況。