齒狀回未成熟顆粒神經元在氯胺酮快速抗抑郁中作用的最新研究進展

魏 盛,耿希文,趙 峰,李自發,張 浩,胡明會

(山東中醫藥大學實驗中心,濟南 250355)

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）已成為威脅人類健康的嚴重疾病之一，具有高患病率、高復發率、高致殘和致死率等特點，被稱為“第一心理殺手”。目前的治療藥物主要是選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI），有30%～40%抑郁患者對該類藥物治療不敏感，起效慢，而且精神性不良反應大，部分患者還會產生耐藥性，有明顯的時間滯后性和低效性［1］。近年來，氯胺酮的快速抗抑郁效果備受人們關注，單次使用氯胺酮就可于數小時內展現出明顯的抑郁癥狀緩解［2］。然而，雖然氯胺酮快速抗抑郁效果理想，臨床應用仍面臨藥物成癮和不良反應等巨大風險，這與該藥物作用機制尚未完全揭示有關。

一直以來，氯胺酮作為一種非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體拮抗劑被人們熟知［3］。Yang等［4］和Cui等［5］曾于Nature雜志同刊發文，首次揭示MDD發生與外側韁核的簇狀放電密切相關，而氯胺酮則可通過阻斷NMDA受體，直接抑制外側韁核的這一異常放電而起到快速抗抑郁效應（圖1）。但是，僅有少數NMDA受體拮抗劑會產生快速抗抑郁作用，這意味著氯胺酮快速抗抑郁效應背后可能涉及其他未知機制。有報告表明，這可能與氯胺酮的代謝產物參與BDNF、eEF2K、mTOR等細胞信號通路調控密切相關［6-8］。盡管有大量圍繞眾多分子信號通路和神經環路參與氯胺酮快速抗抑郁機制的工作給出證據，但人們仍未找到腦內參與這一過程的特異性且可靶向調控的細胞群，這使得該藥物快速抗抑郁機制的腦區及靶向性細胞種類仍存疑惑。

圖1 氯胺酮通過阻斷NMDA受體抑制外側僵核簇狀放電以發揮快速抗抑郁效應Figure1 Ketamine blocks the function of NMDA receptors,decreases neuronal bursting,and rescues depression-like phenotypes

海馬是腦中樞調控精神活動的關鍵區域，其結構功能異常與MDD具有密切關系。有證據表明傳統抗抑郁藥物可增加成年海馬神經再生，如促進海馬顆粒神經元發育，來逆轉抑郁狀態下異常改變。此外，直接抑制海馬神經再生，可阻斷抗抑郁藥對抑郁模型動物行為異常的改善［9］。然而，生成新的顆粒神經元并整合參與到海馬區域的神經環路中往往要花費數周時間，這可能是眾多抗抑郁手段起效緩慢的原因之一。以往研究表明，海馬齒狀回顆粒細胞包括早期顆粒細胞、未成熟顆粒細胞（adult-born immature granule neurons，ABINs）和成熟顆粒細胞。其中，ABINs由于其細胞內在的興奮性高、突觸可塑性強、對外界信息輸入的響應程度高等特點，在抑郁癥等海馬相關的神經系統疾病的研究中備受關注［10］。有證據表明，MDD患者的海馬神經發生顯著減少，在應用抗抑郁手段治療之后可恢復正常［11］。此外，值得關注的是，海馬齒狀回中ABINs的急性激活可從小鼠模型中誘導出快速抗抑郁效果［12］，這在一定程度上為研究氯胺酮快速抗抑郁的可能機制提供了線索與啟示。

2022年5月Nature Communications雜志發表Rawat等［13］的研究論文，報告小鼠海馬齒狀回中ABINs的急性激活是氯胺酮快速抗抑郁作用的可能機制（實驗設計技術路線見圖2）。

圖2 Rawat等（2022年）的實驗設計技術路線解讀示意圖Figure 2 Schematic diagram of the experimental design of Rawat et al.(2022)

研究人員首先利用野生型C57BL/6小鼠，通過三箱社交實驗和懸尾實驗，驗證氯胺酮給藥對小鼠抑郁樣行為及海馬依賴社交記憶的作用。表明單次腹腔注射3 mg/kg氯胺酮24 h后，可顯著增加小鼠社會交互系數和社交新鮮感并縮短懸尾測試的不動時間。

考慮到海馬齒狀回是調控社交行為的關鍵區域，隨后研究人員通過免疫熒光染色特異性標記小鼠海馬齒狀回即刻早期基因cFOS和早期生長應答因子1（early growth response 1，EGR1），驗證氯胺酮快速抗抑郁效應是否伴隨海馬齒狀回細胞激活。結果表明，氯胺酮給藥分別增加了小鼠海馬齒狀回cFOS單陽性和EGR1單陽性細胞數量，提示藥物作用激活了該腦區神經活動。為明確激活細胞的類型，研究人員又對EGR1陽性細胞進行了再次標記。已知神經元成熟過程中，細胞首先會在神經前體細胞階段特異性表達神經源性分化因子1（neurogenic differentiate factor 1，NeuroD1）和雙皮質素（doublecortin，DCX），隨后在神經元階段特異性表達神經元特異性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN），當到達成熟階段會特異性表達鈣結合蛋白（calbindin，Calb），這類蛋白（NeuN和Calb）在未成熟的顆粒細胞是不表達的?；诖?，研究人員對上述幾種特異性標志物與EGR1蛋白進行了熒光免疫組織化學雙標染色，結果顯示：幾乎所有表達EGR1蛋白的細胞均同時呈現NeuN陽性，且幾乎均不表達NeuroD1或DCX。進一步的實驗表明，氯胺酮干預可以顯著增加EGR+Calb-未成熟神經元的數目，對EGR+Calb+成熟神經元的數目沒有明顯作用，提示氯胺酮主要激活了齒狀回中未成熟神經元而發揮快速抗抑郁作用。

為進一步明確激活神經元所處階段，研究人員又對海馬齒狀回區域進行了EGR1和鈣網膜蛋白（calretinin，CR）的雙標染色。CR是神經元有絲分裂后，表達Calb之前瞬時表達的一種蛋白。結果發現氯胺酮顯著增加了EGR1+CR+雙陽性細胞數量，而對EGR1+CR-細胞數量沒有影響。以上表明，氯胺酮激活的是齒狀回中處于表達NeuroD和DCX之后、表達Calb之前的未成熟顆粒神經元，即ABINs。

有研究表明，ABINs的激活可以導致小鼠產生一個顯著的、幾乎瞬時發生的緩解抑郁/焦慮樣行為效應［12］。因此，研究人員假設正是在齒狀回觀察到的ABINs激活介導了氯胺酮快速抗抑郁效應。為了驗證這一假設，利用化學遺傳學結合Ascl1-Cre轉基因模型小鼠，研究人員選擇性地對齒狀回區域ABINs進行了抑制?；瘜W遺傳學方法通過將hM4Di特異性地表達在齒狀回ABINs上，當腹腔注射氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，CNO）后，可以通過啟動經典抑制性Gi通路抑制ABINs活動。如前所述，正常動物中，氯胺酮給藥可顯著提高小鼠的社會交互系數和社交新鮮感并縮短懸尾不動時間，但在接受CNO注射的轉基因動物上，由于齒狀回區域ABINs的活性受到了抑制，氯胺酮抗抑郁效應被屏蔽。進一步的形態學研究結果表明，氯胺酮并沒有影響ABINs總數量，但顯著提高了激活的ABINs（EGR1陽性）數量，在CNO的抑制作用下，氯胺酮增加激活ABINs數量的效應也消失了。以上結果表明，沉默海馬齒狀回的ABINs可顯著抑制氯胺酮快速抗抑郁效應，即海馬齒狀回ABINs的激活是氯胺酮快速抗抑郁的必要條件。

隨后，研究人員選擇慢性不可預知溫和應激制備抑郁癥小鼠模型，評價氯胺酮對模型小鼠抑郁樣行為快速改善效果，進一步探討ABINs在這一過程中的作用。結果表明，模型組動物較對照組動物表現出顯著抑郁樣行為，即社會交互系數和社交新鮮感減少以及懸尾測試不動時間增加，氯胺酮給藥逆轉了這一行為異常。而應用CNO對ABINs進行特異性抑制，則可阻止氯胺酮改善模型小鼠行為異常的作用。因此，氯胺酮的快速抗抑郁效應依賴海馬齒狀回ABINs的激活，這在正常動物和抑郁動物上是一致的。

NMDA受體與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA）受體是成熟興奮性神經元上的兩種主要離子型谷氨酸受體，它們與離子通道耦聯，形成受體通道復合物，參與介導多項神經生理功能。NMDA受體通過受體本身、其共軛的離子通道以及調節部位這三個部分形成的復合體而發揮功能，對鈣離子高度通透；
AMPA受體則對鈉離子和鉀離子的通透性強。研究表明，NMDA和AMPA受體均參與MDD的發病以及抗抑郁藥物的作用機制［14］。包括氯胺酮在內的多種NMDA拮抗劑被證實具有顯著的抗抑郁作用［2］。亦有研究表明，AMPA受體參與氯胺酮快速抗抑郁機制，抑制AMPA受體可屏蔽氯胺酮的快速抗抑郁效應［15］。為了驗證ABINs激活是否整合到上述AMPA受體相關的氯胺酮作用機制，研究人員探查了抑制AMPA受體是否可以阻斷氯胺酮對ABINs的激活及其介導行為效應。與以往大量研究結果一致，當給予小鼠AMPA受體拮抗劑NBQX后，氯胺酮的快速抗抑郁效應被明顯阻斷。此外，NBQX也阻斷了氯胺酮增加EGR+Calb-細胞數量的效果。以上證據表明，氯胺酮通過激活ABINs發揮快速抗抑郁效應是依賴AMPA受體實現的。

對ABINs激活在氯胺酮快速抗抑郁中作用進行必要性驗證后，研究人員又進行了充分性驗證。研究人員將hM3Dq特異性表達在齒狀回ABINs上，當腹腔注射CNO后，可以通過激活Gq通路提高細胞活性。應用慢性不可預知溫和應激制備抑郁癥模型小鼠后，分別予CNO和氯胺酮給藥，結果表明，CNO激活齒狀回ABINs 24 h后，產生了與氯胺酮給藥類似的快速抗抑郁效應，表現為小鼠的社會交互系數和社交新鮮感增加以及懸尾不動時間縮短。進一步的形態學證據表明，CNO和氯胺酮給藥均可增加齒狀回區域激活的ABINs（EGR1+）數量。以上證據表明，直接激活海馬齒狀回的ABINs可模擬氯胺酮的快速抗抑郁效應，即激活海馬齒狀回ABINs是氯胺酮快速抗抑郁的充分條件。

Rawat等［13］的研究采用免疫熒光染色和化學遺傳學方法，通過正向/反向驗證，分別對海馬齒狀回中的ABINs進行了特異性抑制和激活，證明齒狀回ABINs的激活是氯胺酮發揮快速抗抑郁效應的關鍵機制，且進一步的證據表明，上述作用是依賴于AMPA受體介導實現。

眾所周知，氯胺酮可發揮顯著的快速抗抑郁效應，但單次給藥的藥效消退后，反復氯胺酮用藥極易引起藥物成癮和不良反應［16］。藥物進入體內后無差別作用于廣泛腦區，既能產生治療作用，也能帶來不良反應。因此，進一步探查藥物作用的腦區和細胞類型，從而進行特異性靶向用藥，可能是消除氯胺酮不良反應的可行途徑之一。Rawat等［13］的研究從ABINs這一視角揭示了氯胺酮快速抗抑郁機制，鎖定了其作用的特定腦區和細胞類型，有助于圍繞該特定靶點開發新型快速抗抑郁藥物。

在Rawat等［13］的研究中，利用化學遺傳學特異性激活/抑制ABINs為探查該類神經元的作用提供了強大方法學支撐。hM4Di和hM3Dq在ABINs中的特異性表達，使得調控該類神經元的活動成為可能，且補充實驗中證實這一特異性的操控并未對神經再生和固有ABINs數量造成影響，排除了可能的干擾因素，使得其方法學體系更為嚴謹可信。利用化學遺傳學手段，Rawat等［13］通過正向抑制/反向激活的充分必要驗證，證實了海馬齒狀回ABINs的激活參與氯胺酮快速抗抑郁機制，結合進一步的藥理學方法，發現了該作用依賴于AMPA受體的參與。然而，也有大量報告證實其他類型AMPA受體激動劑也可發揮抗抑郁效應［17］，但其作用有效性遠不及氯胺酮。因此，筆者認為應當通過進一步的實驗驗證氯胺酮是否也靶向其他腦區的AMPA受體，或同時作用于其他相關靶點，從而發揮快速抗抑郁效應。

以往研究中，關于氯胺酮快速抗抑郁機制的假說大多關于NMDA受體，該假說認為氯胺酮對于該受體的競爭性抑制作用是介導其快速抗抑郁效果的關鍵，這在嚙齒類動物模型為研究對象的實驗中已經得到了證實。當氯胺酮選擇性阻斷NMDA受體對γ-氨基丁酸能神經元的作用后，會導致錐體神經元產生去抑制和谷氨酸爆發，繼而導致AMPA受體活性增強，BDNF釋放增多，TrkB激活等后續細胞內級聯反應［6］。也有證據表明，氯胺酮阻斷NMDA受體后，可以導致eEF2去磷酸化，也可導致AMPA受體活性的增強［7］。Rawat等［13］的研究證實，氯胺酮可以激活ABINs，且該過程依賴AMPA受體的參與，這與以往報告一致。

成年人海馬區域的神經元是否可以再生？這一問題是神經科學家們一直爭論的焦點。但亦有大量證據表明海馬區域有神經新生，且DCX陽性細胞即可在一定程度上被認為是新生細胞。海馬神經新生被廣泛證實參與記憶、認知和情緒等多種生理機能。有研究指出，激活海馬內的新生神經元可以直接發揮抗抑郁/焦慮效應［12］。這也證實，海馬神經新生高度參與抑郁情緒調控，并且可能是抗抑郁藥物的潛在靶點，這一過程可能包括神經前體細胞、未成熟顆粒細胞、成熟神經元等在內的多個環節。Rawat等［13］研究發現氯胺酮可以直接激活DCX陽性細胞，進一步的證據表明氯胺酮是激活了ABINs，從而發揮快速抗抑郁作用。這與上述海馬神經新生在抑郁/抗抑郁治療中的相關性相吻合。此外，在Rawat等［13］的研究中，對于抑郁樣行為的評價主要采用了小鼠社會交互實驗和懸尾實驗。社會交互實驗主要用于評價動物對外界環境或個體的探索傾向，而懸尾實驗則通過評價其“行為絕望”狀態而反應抑郁情緒的程度，均未涉及對抑郁癥核心癥狀“快感缺失（Anhedonia）”的評價，造成模型表面效度不佳，和臨床原型差距較大，說服力不足。因此筆者建議行為檢測中引入如糖水偏好、噴糖實驗、雌性尿液嗅探等一種或幾種測試方法，可更為全面地評價模型行為表型及抗抑郁藥效。

近年來，關于氯胺酮快速抗抑郁機制的研究不勝枚舉，有多種細胞信號通路被證實參與這一過程［6-8］，且隨著神經環路記錄、鑒定及示蹤技術的發展，氯胺酮快速抗抑郁的神經環路機制也逐漸被揭示［18］（圖3）。大量文獻證據表明，海馬是氯胺酮快速抗抑郁的作用腦區，但除海馬外，其他多個腦區也參與了氯胺酮的藥效過程。神經發生是指由神經干細胞產生神經元的過程，成年個體神經發生有比較活躍的兩個區域：一個是側腦室的腦室下區，新生神經元由此處生成并遷移至嗅球或者紋狀體；
另一重要區域是海馬齒狀回。成年哺乳動物的海馬區域中的神經發生是由活化神經干細胞增殖產生子代，包括神經前體細胞，進一步分裂成為未成熟的齒狀回顆粒神經元，整合到局部神經環路當中。即未成熟的齒狀回顆粒神經元與CA1和CA3的錐體神經元三者形成三突觸回路，信息由內嗅皮層到達齒狀回，然后通過顆粒細胞到達CA3錐體細胞，再從CA3區神經元投射到CA1錐體細胞，最后再返回內嗅皮層［19-20］。此外，近年有學者指出，ABINs可通過谷氨酸能投射作用于γ-氨基丁酸能神經元，而抑制成熟顆粒細胞的活性［21］。因此，在Rawat等［13］的研究結論基礎上，可結合環路示蹤和鑒定技術進一步明確海馬齒狀回ABINs的上/下游投射是否參與了氯胺酮快速抗抑郁機制。神經環路方面近年來多個課題組工作表明，內側前額葉皮質與腦內多個部位的投射廣泛參與到氯胺酮的快速抗抑郁作用中［22］。Rawat等［13］所揭示的海馬齒狀回區域與包括內側前額葉皮質在內的多個腦區存在密切的纖維投射聯系，綜合利用先進的在體/離體神經環路鑒定技術，如光/化學遺傳操控、膜片鉗記錄、神經示蹤、光纖記錄、超微顯微成像、雙光子觀測、功能磁共振檢測等，結合藥理學及分子生物學手段，圍繞齒狀回及其相關聯腦區的神經環路在氯胺酮快速抗抑郁中的機制展開廣泛且深入的研究，將為藥物作用靶點的揭示提供更為充足的實驗證據。

圖3 氯胺酮快速抗抑郁的神經環路機制示意圖Figure 3 Neural circuits involved in the antidepressant actions of ketamine

筆者所在課題組一直從事抑郁癥發生及藥物干預的分子及神經環路機制研究，已經圍繞內側前額葉皮質在抑郁癥發生機制中的作用展開了系列工作（結果尚待發表）。筆者課題組前期工作證實，內側前額葉皮質中γ-氨基丁酸能中間神經元對錐體神經元的過度抑制作用是抑郁癥發生的可能機制，而快速抗抑郁藥物可使中間神經元抑制功能發生短暫降低，γ-氨基丁酸合成減少，從而產生去抑制作用，進而發揮抗抑郁藥效。此外，利用光纖鈣信號記錄及超微顯微成像技術，課題組前期實驗觀測到內側前額葉皮質γ-氨基丁酸能神經元在抑郁樣行為發生過程中伴隨顯著的神經鈣活動變化，而抗抑郁藥干預可有效逆轉上述變化，進一步提示該腦區γ-氨基丁酸能神經元與抑郁癥發生及抗抑郁藥作用密切相關。

如上所述，內側前額葉皮質與海馬區域存在廣泛纖維投射聯系，內側前額葉皮質中γ-氨基丁酸能神經元介導的去抑制是否可通過傳出投射作用于海馬神經元，進而調控抑郁癥發生？內側前額葉皮質中γ-氨基丁酸能神經元的改變是否由海馬向其發出的上游投射參與介導？接下來，筆者課題組將圍繞上述科學問題，進一步探索內側前額葉皮質與海馬間神經環路在抑郁癥發生及抗抑郁藥作用中的機制。

另外，Rawat等［13］的研究表明，齒狀回ABINs的激活參與了氯胺酮的快速抗抑郁機制，并且排除了神經再生即固有ABINs數量與這一過程的關聯，證實氯胺酮的快速抗抑郁作用是通過激活ABINs即可起效而不必依賴神經再生介導。然而，有大量證據表明，海馬神經元的突觸可塑性與氯胺酮的持續抗抑郁作用具有密切聯系［23］。我們有理由推測，氯胺酮的持續抗抑郁作用可能與神經再生密切相關，而海馬齒狀回可能是氯胺酮發揮快速且持續抗抑郁效應的共有靶向區域；
圍繞該問題開展進一步的系統性實驗驗證，對揭示氯胺酮起效的更廣泛機制，進而開發針對性治療藥物，具有重大意義。

雖然各國食品藥品監督管理部門已經批準氯胺酮作為重度抑郁癥治療藥物使用，近年來也有藥物研發企業針對該藥物開發不同新劑型投入使用，但面臨的成癮、不良反應等風險一直是制約氯胺酮在臨床廣泛應用的棘手問題。進一步深入揭示氯胺酮的可能作用靶點，圍繞相關靶點開展針對性治療藥物開發，是目前亟待解決的共識性問題。

[作者貢獻Author Contribution]

魏盛撰寫和修改文稿；
耿希文撰寫文稿；
趙峰作圖并修改文稿；
李自發修改文稿；
張浩檢索文獻并作圖；
胡明會檢索文獻。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。