不同儲藏條件下鱖魚樣品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的降解規律研究

摘 要：鱖魚稀少、名貴、難養，是孔雀石綠（MG）及其主要代謝物隱色孔雀石綠（LMG）殘留重災區。為確定鱖魚樣品中用于開展能力驗證藥物的適宜儲存條件和運輸溫度條件，最大限度消除外因對MG及LMG檢測結果的影響，保證結果的可靠性，以鱖魚肌肉為研究對象，開展了MG及LMG殘留降解規律研究。實驗分析了MG和LMG在3種濃度（5.0、10.0、50.0 μg/kg）和3種貯藏條件（室溫20～25℃，冷藏0～4℃和冷凍-18℃）下隨時間的降解規律。實驗結果表明，不同濃度的MG和LMG均有不同程度的降解，但因貯藏條件的不同，降解速率各不相同。在各種貯藏條件和不同濃度加標情況下，鱖魚樣品中LMG代謝消除速率均顯著慢于MG；且因LMG的毒性遠大于MG，建議將LMG作為殘留檢測的主要標志物。受酶活性高低的影響，貯藏條件對MG和LMG代謝的影響較大，降解速率為常溫>冷藏>冷凍。如果樣品能盡快進行檢測，即可在常溫條件下進行短期保存；如樣品不能盡快安排檢測，則須冷凍保存，盡量保持樣品的原有屬性。

關鍵詞：孔雀石綠；隱色孔雀石綠；殘留；降解；鱖魚

中圖分類號：X592 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2014）09-0069-06

孔雀石綠（Malachite Green，MG）為三苯甲烷類工業染料，同時還是一種有效殺滅霉菌的染料類藥物，對真菌和寄生蟲有較好的殺滅效果[1]，在水產業得到了廣泛應用。因其是3個芳香胺的聚合物，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2-4]。自1980年發現孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠（Leuco Malachite Green，LMG）具有潛在的致癌性以來，美國、日本以及英國等許多國家已禁止其用于水產養殖業。中華人民共和國農業行業標準 NY5071-2002《無公害食品漁用藥物使用準則》已將孔雀石綠列為禁用藥物[5]，在水產品中“不得檢出”。但是，由于孔雀石綠效高價廉、管理力度不夠、替代品少等原因，不少漁民還在小范圍使用，這不可避免地帶來了其在水產品中殘留和環境污染的問題[6]。

鱖魚肉質細嫩且豐厚堅實，富含蛋白質，味道鮮美，且內部無膽少刺，故自古以來就是宴席上的美味佳肴。鱖魚還可以補五臟、益脾胃、充氣胃、療虛損，適用于氣血虛弱體質，可治虛勞體弱、腸風下血等癥，是一種名貴的魚類[7]。目前國內外消費市場對鱖魚需求量日益增長，但鱖魚終生以活魚蝦為食，野生資源量因受多種因素影響而日趨衰減；養殖技術含量高，易感染疾病，死亡率高，產量遠遠低于普通魚類。因孔雀石綠對真菌和寄生蟲有較好的殺滅效果，在鱖魚養殖和運輸過程中可以減少其感染疾病的幾率，保持鮮魚的高成活率，故在鱖魚中經常被使用。在檢出孔雀石綠的水產品中[8]，鱖魚是檢出率最高的品種之一。華永有等[9]對市售淡水魚進行孔雀石綠及其代謝物殘留量調查研究時發現，鱖魚中孔雀石綠的檢出率竟高達92.9%，表明鱖魚已經成為孔雀石綠及其代謝物殘留的重災區。以往的研究多集中在實驗活體動物的代謝上，而不同貯藏條件對鱖魚中孔雀石綠及其代謝物檢測結果的影響還沒有相關報道。本實驗通過研究不同濃度的孔雀石綠在不同貯藏條件下的鱖魚加標樣品中的穩定性，以期篩選出適宜開展能力驗證的藥物品種的儲存條件和運輸溫度條件，最大限度消除外因對檢測結果的影響，以保證結果的公正性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器 高效液相色譜-三重串聯四級桿質譜儀，配ESI 源（TSQ Quantum Access，賽默飛世爾公司）；步琪平行蒸發儀（Q-101，瑞士buchi公司）；超聲波清洗儀（KQ-1000DE，昆山市超聲儀器有限公司）；快速混勻器（SK-1，江蘇中大儀器廠）；高速冷凍離心機（CR22GⅢ，日本TITACHI公司） ；固相萃取裝置（20-Port SPE Manifold，美國安捷倫儀器設備公司）；天平（AB135-S，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.1.2 試 劑 孔雀石綠（德國Witega實驗室公司，純度>99%），氘代孔雀石綠（德國Witega實驗室公司，純度>99%），隱色孔雀石綠（德國Witega實驗室公司，純度>99% ），氘代隱色孔雀石綠-D6（德國Witega實驗室公司，純度>99%）；乙腈（色譜純，美國天地試劑公司）；中性氧化鋁柱（1 g，3 mL，美國SUPELCO公司）；無水乙酸銨（色譜純，美國天地試劑公司，純度>98%）；水為娃哈哈超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準貯備液：分別準確稱取10.0 mg孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠，用乙腈溶解，定容至100.0 mL，配制成100.0 μg/mL的標準貯備液，-18℃避光保存?；旌蠘藴使ぷ魅芤海河靡译嫦♂屔鲜龌旌蠘藴寿A備液，配制成濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/kg的孔雀石綠、隱性孔雀石綠及內標濃度為2.0 μg/kg混合標準溶液，置于-18℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理 鮮活鱖魚，來自湖南省水產科學研究所漁場。將魚去磷去皮后，沿脊背取肌肉部分，搗碎樣品均質，分別加入一定濃度孔雀石綠和隱色孔雀石綠標準液，制成添加水平分別為5、10、50 μg/kg的加標樣品，充分渦旋混合均勻，將3種加標濃度水平的樣品分別置于室溫（20～25℃ ）、冷藏（0～4℃ ） 和冷凍（- 18℃ ） 條件下。在室溫（20～25℃ ） 條件下，分別于第0、1、2、3、4、5、6 天取出；冷藏（0～4℃ ） 條件下，分別于第0、1、2、3、5、7、9天取出；冷凍（-18℃ ） 條件下，分別于第0、1、2、3、5、10、15、20、30、40、50、60天取出。每個樣品設3個平行樣。按下述步驟進行檢測分析。

1.2.3 樣品處理 實驗按GB/T19857—2005水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定（液相色譜-串聯質譜法）中鮮活水產品的處理步驟進行。

1.3 測 定

1.3.1 高效液相色譜-質譜聯用儀質譜條件 液相色譜條件：色譜柱：Hypersil Gold柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；流動相：A——乙腈，B——5 mmol/L 乙酸銨（含0.1%的甲酸）；流速：0.30 mL/min。洗脫程序（A）：0～1.0 min，10%；1.0～8.0 min，10%～90%；8.0～10.0 min，90%～10%；10.0～15.0 min，10%。

質譜條件：掃描模式：加熱電噴霧離子源（HESI），正離子模式（Positive polarity）；噴霧電壓（Spray voltage）：3 500 V；鞘氣壓力（ Sheath gas，N2）；40 u，輔助氣流量（Aux gas，N2）：10 u；離子傳輸毛細管溫度（Capillary temperature）：340℃ ；源內誘導解離電壓：6 V；碰撞氣（Collision， Ar）：1.5 u；離子吹掃氣（ Ion sweep gas，N2）：0 u；掃描模式：選擇反應監測（SRM）；監測離子對：孔雀石綠m/z 329/313、329/208（定量離子），隱色孔雀石綠m/z 331/316、331/239（定量離子），氘代孔雀石綠 m/z 334/318（定量離子），氘代隱色孔雀石綠 m/z 337/322（定量離子）。

1.3.2 液相色譜—串聯質譜測定 按照1.3.1液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和混合標準工作溶液，正離子模式掃描，選擇反應監測（SRM），內標法定量。在上述色譜條件下，孔雀石綠、氘代孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠分離度及峰形良好，參考保留時間分別為6.83、6.82、9.17、9.23 min。標準溶液的離子流圖如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 常溫貯藏對不同濃度MG和LMG代謝降解的影響

在常溫下，鱖魚樣品放置2～3 d開始產生異味，放置6 d后，已經完全腐敗，所以選用6 d作為研究時段。從表1中可以發現，經過放置6 d，3種濃度水平的MG和LMG均有不同程度的降解，其中MG的降解程度要比LMG的大得多：低濃度的MG（加標濃度：5.00 μg/kg）由5.34 μg/kg降解至2.55 μg/kg，與初始檢測濃度相比降低了52.25%，而低濃度的LMG則由5.60 μg/kg降解至3.98 μg/kg，降解了29.06%；中濃度的MG（加標濃度：10.00 μg/kg）經過6 d后，檢測的結果為6.24 μg/kg，降解了36.78%，中濃度的LMG則由10.08 μg/kg降解至8.85 μg/kg，降解了20.8%；高濃度的MG（加標濃度：50.00 μg/kg）經過6 d后，測定值為25.60 μg/kg，最終降解了46.89%，而高濃度的LMG檢出值為37.60 μg/kg，降解了28.11%。

2.2 冷藏對不同濃度MG和LMG代謝降解的影響

在冷藏條件下，鱖魚樣品經過9 d接近腐敗。從表2中可以看出，經過9 d的冷藏，3種濃度水平的MG和LMG降解的程度不一樣，但總體來說LMG的降解程度比MG的要小一些：低濃度的MG（加標濃度：5.00 μg/kg）由5.35 μg/kg降解至2.01 μg/kg，與初始檢測濃度相比降低了62.43%，而低濃度的LMG則由5.41 μg/kg降解至3.25 μg/kg，降解了39.93%；中濃度的MG（加標濃度：10.00 μg/kg）經過9 d后，檢測的結果為5.54 μg/kg，降解了45.15%，中濃度的LMG則由11.00 μg/kg降解至8.01 μg/kg，降解了27.18%；高濃度的MG（加標濃度：50.00 μg/kg）經過9 d后，測定值為29.40 μg/kg，最終降解了42.91%，而高濃度的LMG檢出值為39.40 μg/kg，降解了26.22%。

2.3 冷凍對不同濃度MG和LMG代謝降解的影響

在冷凍情況下，鱖魚樣品可以長時間保存。3種濃度水平的鱖魚加標樣品在冷凍條件下存放60 d，樣品無腐敗現象。由表3可知，與前兩種放置條件相似，3種濃度水平的MG和LMG降解的程度不一樣，LMG的降解程度比MG的要小一些：低濃度的MG（加標濃度：5.00 μg/kg）由5.26 μg/kg降解至1.34 μg/kg，與初始檢測濃度相比降低了74.52%，而低濃度的LMG則由5.53 μg/kg降解至3.12 μg/kg，降解了43.58%；中濃度的MG（加標濃度：10.00 μg/kg）經過60 d后，檢測的結果為3.90 μg/kg，降解了62.14%，中濃度的LMG則由10.20 μg/kg降解到6.21 μg/kg，降解了39.12%；高濃度的MG（加標濃度：50.00 μg/kg）經過60 d后，測定值為25.00 μg/kg，最終降解了52.29%，而高濃度的LMG測定值為32.90 μg/kg，降解了38.50%。

3 討 論

3.1 隱色孔雀石綠代謝降解的速率顯著慢于孔雀石綠

在各種貯藏條件和不同濃度加標情況下，隱色孔雀石綠代謝消除速率均顯著小于孔雀石綠，如圖2、圖3所示。例如，在常溫下，低濃度孔雀石綠代謝速率為0.47 μg/（kg·d），而隱色孔雀石綠差不多是其1/2，為0.27 μg/（kg·d），隱色孔雀石綠的代謝速率遠遠低于孔雀石綠的代謝速率。Alboralila等[10]研究發現隱色孔雀石綠在虹鱒體內的消除速率顯著慢于孔雀石綠。在血漿中，孔雀石綠在用藥后1～2 d內降到檢測限（5 μg/kg） 以下，而隱色孔雀石綠在4周后仍能檢測到。邱緒建等[11]研究發現孔雀石綠在鯽魚體內的代謝呈對數曲線下降，孔雀石綠在鯽魚體內代謝時間短，大約10 d能完全消除。而隱色孔雀石綠消除曲線較孔雀石綠平緩，消除時間較長，至30 d時仍有17.7 μg/kg的殘留。本實驗結果與以前的報道一致。隱色孔雀石綠代謝消除慢于孔雀石綠，同時由于隱色孔雀石綠的毒性遠大于孔雀石綠[12] ，因此建議選用隱色孔雀石綠作為殘留檢測的主要標志物。

3.2 貯藏條件對孔雀石綠及其代謝物的降解影響

相同濃度下的加標在不同的貯藏條件下，代謝速率差異較大。圖4、圖5分別顯示了孔雀石綠和隱色孔雀石綠的降解速率，常溫條件的降解速率>冷藏條件的降解速率>冷凍條件的降解速率。酶的活性受溫度影響很大，常溫下，酶的活性強，對促進孔雀石綠及隱色孔雀石綠降解的作用明顯，因此兩者降解速率較大；反之，當溫度低時，二者的降解速率變慢。此外，受水溫、鹽度、pH值、溶氧、魚種以及藥物濃度的影響[11]，孔雀石綠及其代謝物的代謝速率會不一樣。在冷凍狀態下，短時間內孔雀石綠的穩定性較好，不易代謝降解。因此，在進行鱖魚樣品的檢測分析時，建議盡快進行檢測，如若不能滿足條件，則需要對樣品進行冷凍處理，從而保證樣品的檢測結果最大限度地接近原來的屬性，避免因代謝降解而影響檢測結果。

3.3 不同濃度水平對孔雀石綠及隱色孔雀石綠降解的影響

不同濃度添加的樣品代謝速率不太一致。在常溫下，孔雀石綠和隱色孔雀石綠一致，都是低濃度降解速率>高濃度降解速率>中濃度降解速率；在冷藏條件下，孔雀石綠降解情況為低濃度>高濃度>中濃度，而隱色孔雀石綠則為低濃度>中濃度>高濃度，不過中濃度和高濃度的降解速率相差不大；在冷凍情況下，均為低濃度>中濃度>高濃度（圖6）。由圖6可知，在冷凍條件下，孔雀石綠降解速率較慢，在樣品的保存中，可選擇將樣品處于-18℃冷凍保存。不同濃度添加量的降解不一樣，穆迎春等[13]利用草魚和鯉魚研究孔雀石綠在不同貯藏條件下的降解發現，草魚和鯉魚在不同濃度下降解速率均不相同。不同濃度水平下，孔雀石綠降解速率可能與樣品基質有關系[13-14]。有研究表明，在代謝過程中，隱色孔雀石綠與孔雀石綠可以相互轉換，由孔雀石綠的代謝機理得知，隱色孔雀石綠在氧化酶的作用下被重新氧化成孔雀石綠[14]，而孔雀石綠在還原劑（如硼氫化鉀）作用下代謝成隱色孔雀石綠，高濃度水平時，兩者相互轉化的水平較高，降解速率較慢。此外，還有研究表明，孔雀石綠（或隱色孔雀石綠）的降解速率主要依賴于魚體的脂肪含量，脂肪越高，降解速率越快[13]；鱖魚脂肪含量較低[14]，故相對于鱈魚和鯉魚等脂肪量高的魚類，降解速率較慢。

參考文獻：

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[3] Fernandes C，Lalitha V S，Rao V K. Enhancing effect of malachite green on the development of hepatic pre-neoplastic lesions induced by N-nitrosodiethylamine in rats[J]. Carcinogenesis，1991，12（5）： 839-845.

[4] Rao K V K. Inhibition of DNA synthesis in primary rat hepatocyte cultures by malachite green： a new liver tumor promoter [J]. Toxicology Letters，1995，81 （2-3）： 107-113.

[5] 中華人民共和國農業部. 中華人民共和國農業部公告第193號（食品動物禁用的獸藥及其化合物清單）[EB/OL].http：//.cn/qkpdf/hnkx/hnkx201409/hnkx20140920-2.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文