利用轉基因斑馬魚快速檢測水體抗生素污染

材料與方法

1.1 材料

試驗藥品：鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素（Biotopped，北京）。斑馬魚：ABIX野生型、Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）轉基因型品系購自國家斑馬魚資源中心（CZRC）。儀器設備：斑馬魚養殖系統（愛生科技發展有限公司，北京）;BPC-250 F型生化培養箱（一恒科學儀器有限公司，上海）;X71熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）;一次性吸管、培養皿、塑料六孔細胞培養板（TrueLine，美國）;三卡因甲磺酸鹽麻醉劑（簡稱TMS，CAS編號：886-86-2，Sigma-Aldrich公司，美國）;氯化鈉、碳酸氫鈉等化學藥品均為分析純，購自西隴科學股份有限公司;Heal Force超純水系統（力康集團，香港）。

1.2 3種抗生素的毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗：為保證對照組胚胎死亡率小于5%，排除未受精及異常胚胎對毒性評價的干擾，本試驗選擇在受精后48 h（48 hpf）開始暴露藥物。收集到胚胎6 h后，去除異常和死胚，最后挑選出發育正常的胚胎。試驗濃度范圍根據預試驗結果設置，將提前配制的高濃度儲備液用藍水稀釋到不同梯度，包含1個對照組，5個處理組。每個處理組包含3個生物學重復，20個胚胎為1個重復。試驗在6孔板中進行，每孔加入20個健康胚胎，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的處理液5 mL，對照組加入等體積藍水。采用半靜態方式進行暴露處理，將培養皿置于恒溫生化培養箱中，暴露總時間為96 h（即從48 hpf～144 hpf），培養箱孵化溫度為（28±0.5） ℃，處理液pH值維持在7，電導率約510 μS/cm，溶氧量>6 mg/L，胚胎保持光 —暗周期為14 h—10 h。毒性試驗對斑馬魚胚胎每24 h更換1次處理液，及時挑出死亡的胚胎。每24 h對斑馬魚胚胎進行1次鏡檢觀察，計量不同時期的各項生理指標和死亡、畸形等數據，進行記錄。

1.3 抗生素對血管發育的影響

3種抗生素的不同濃度對48 hpf的Flk1斑馬魚胚胎暴露24 h，然后用熒光顯微鏡觀察節間血管的直徑。

1.4 抗生素對CYP1A蛋白表達的影響

在對CYP1A和Flk1的試驗中，斑馬魚胚胎于48 h用滅過菌的鑷子顯微鏡下手動破膜，并挑選出正常發育的幼魚。3種抗生素的不同濃度對48 hpf的CYP1A斑馬魚胚胎暴露 24 h，然后用熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.5 試驗時間及地點

試驗于2017年5月至2018年2月，在海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室進行。

1.6 數據統計

CYP1A斑馬魚胚胎觀察其頭部熒光強度，用軟件Image J反轉成灰度值分析出其熒光強度，最終以熒光強度值相互比較;Flk1斑馬魚胚胎觀察其血管發育情況，選取中間部位的節間血管用Image-Pro plus分析出血管的直徑，試驗每組每個濃度胚胎數量至少20個。所有數據用SPSS分析，graphpad作圖。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚胚胎毒性試驗

2.1.1 鹽酸鹽酸慶大霉素對胚胎死亡率的影響 根據預試驗結果，藥物暴露96 h后，900 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，所以筆者選用900 μg/mL為鹽酸慶大霉素的最高濃度。如圖1-A，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素的毒性開始顯露，當鹽酸慶大霉素為180 μg/mL時胚胎開始出現極少數死亡，死亡率只有2.5%。

2.1.2 硫酸硫酸卡那霉素對胚胎死亡率的影響 預試驗結果表明，藥物暴露96 h后，1 000 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，藥物暴露24 h后從200 μg/mL開始出現死亡（圖1-B）。

2.1.3 鹽酸萬古霉素對胚胎死亡率的影響 鹽酸萬古霉素不同濃度暴露96 h后，筆者發現當鹽酸萬古霉素濃度為 1 200 μg/mL 時幼魚全部死亡，因此將1 000 μg/mL設為處理的最高濃度。藥物暴露24 h后當鹽酸萬古霉素濃度為 300 μg/mL 時胚胎開始出現死亡，表明鹽酸萬古霉素的毒性發生點在200 μg/mL濃度持續處理24 h處（圖1-C）。

2.2 抗生素對血管發育的影響

根據抗生素對胚胎處理24 h毒性的影響（圖1），鹽酸慶大霉素選用40、80、120 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;硫酸卡那霉素選用50、100、150 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;鹽酸萬古霉素選用80、160、240 μg/mL濃度處理幼魚。鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素處理組的節間血管發育與對照（0 μg/mL）相比無顯著差異，當鹽酸萬古霉素濃度為240 μg/mL處理時胚胎血管直徑與對照出現顯著差異（P<0.05）（圖2、圖3），節間血管的直徑減少至2 μm以下。

2.3 抗生素對CYP1A蛋白表達的影響

預試驗表明，隨著藥物處理時間的延長，幼魚最先出現綠色熒光的是腦部。由圖4可知，藥物暴露24 h后，這3種抗生素低濃度時可以促進CYP1A蛋白質的表達，并有濃度依賴性。由圖4、圖5可知，2 μg/mL鹽酸慶大霉素處理組開始出現熒光，隨著濃度增加各組間熒光強度逐漸增強并具有顯著差異（P<0.05）;4 μg/mL硫酸卡那霉素處理組開始出現熒光，6 μg/mL處理組的熒光強度是4 μg/mL組的4倍，各組與對照組均具有顯著差異（P<0.05）;其中，CYP1A蛋白對鹽酸萬古霉素的敏感性比鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更強，在0.4 μg/mL處理組就開始出現熒光，相比于氨基糖苷類的鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更敏感。

3 討論

氨基糖苷類抗生素具有較強的腎毒性和耳毒性[16]，其濫用濫排現象已對人類和動物的生存環境構成威脅。鹽酸萬古霉素屬糖肽類抗生素，起初因良好的耐藥菌治療效果在畜牧行業大量使用，因其濫用造成耐鹽酸萬古霉素菌快速形成。這些表明，環境中抗生素的污染不容小覷，因此，抗生素的早期檢測是非常重要的。筆者希望轉基因斑馬魚在作為現代醫學模式動物“寵兒”的同時，也能在水環境監測中起到作用。

Flk1（EGFP）斑馬魚是針對血管發綠色熒光的轉基因斑馬魚，Cross等運用G-RCFP標記插到VEGF2基因的啟動子序列表達，從而得到了有綠色熒光血管的轉基因斑馬魚，能很清楚地觀察到血管的狀態[17]。利用血管的可視化，可以快速準確地看出藥物對血管的作用，本試驗結果表明，鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素在一定濃度下對血管發育沒有明顯影響，而鹽酸萬古霉素在較高濃度時才有抑制血管生成的作用，這說明Flk1轉基因斑馬魚不適用于這3種抗生素的快速檢測。

CYP1A屬于細胞色素P450超家族，廣泛分布于腦、肝及其他很多部位中，參與烴類致癌物的代謝，CYP1A2在肝組織中有特異性表達，參與許多前致癌物和前毒物的代謝活化[18]。CYP1A轉基因斑馬魚目前在水質檢測方面較多應用于多環芳香烴類化合物的檢測[19]，很少用于其他污染物的檢測。Ohlsen等檢測醫院廢水中的抗生素濃度，其中鹽酸慶大霉素的濃度不低于0.01 mg/L[20]。本試驗數據表明，鹽酸慶大霉素和硫酸硫酸卡那霉素濃度分別為2 μg/mL和4 μg/mL時，CYP1A斑馬魚頭部開始出現熒光。鹽酸萬古霉素濃度為0.4 μg/mL時，幼魚頭部開始出現熒光，這表明CYP1A對鹽酸萬古霉素更敏感。所以CYP1A具有作為氨基糖苷類化合物生物監測手段的潛力。

4 結論

隨著基因工程技術的發展，轉基因斑馬魚技術也越來越成熟。本試驗得出，CYP1A斑馬魚在用于檢測鹵化芳香族碳氫化合物的同時，也可以作為其他部分化合物的生物標記。Flk1斑馬魚對這3種抗生素的敏感程度太低，所以不適合作為這3種抗生素的檢測手段。這說明一種轉基因斑馬魚在用于醫學定向研究的同時可能還具有用于檢測水體中化合物污染的作用，這進一步擴展了轉基因斑馬魚的用途，為水體環境污染的快速監測提供了更經濟方便的手段。

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