阿立哌唑改善帕金森病伴發抑郁模型大鼠行為學及能量代謝*

馬 敬, 仲照?！? 岳凌峰, 王瑜璞, 李 炎

新鄉醫學院第二附屬醫院 1心境障礙一科 2精神四科,新鄉 453000

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是老年人群中常見的神經系統變性疾病,主要病理表現為中腦黑質多巴胺能神經元變性死亡引起的紋狀體多巴胺減少,臨床表現出靜止性震顫、肌強直、運動遲緩等運動癥狀,同時部分患者還伴有抑郁、睡眠障礙、癡呆等非運動癥狀,其中以抑郁最為常見[1-2]。臨床統計發現,帕金森病發病過程中,約有一半以上的患者會出現抑郁癥狀,不僅增加患者精神痛苦,還會加重患者認知功能和身體運動損傷,進一步加重帕金森病情,嚴重影響患者生活質量[3]。目前,帕金森病抑郁癥(Parkinson’s disease depression,PDD)的發病機制尚未完全清楚,其治療也以抗抑郁藥物治療為主。阿立哌唑(Aripiprazole)是一類新型的抗精神分裂癥藥物,可雙向調節多巴胺能神經系統[4]。Luan等[5]研究顯示,輔助應用Aripiprazole治療難治性抑郁癥有較好的療效和安全性。但Aripiprazole對PDD癥狀是否有緩解作用尚未可知。本研究通過構建PDD大鼠模型,觀察Aripiprazole對PDD大鼠行為學的作用,并初步分析其相關機制,旨在為Aripiprazole應用于PDD治療提供實驗依據。

1.1 動物來源

60只SD大鼠,SPF級,雄性,體質量180～220 g,6～8周齡,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格證編號為SCXK(京)2019-0125,飼養于室溫20～25 ℃、相對濕度60%～70%、12 h晝夜交替的動物房中,自由攝食飲水,實驗前大鼠適應性飼養7 d。

1.2 藥品與主要試劑

Aripiprazole(江蘇恩華藥業股份有限公司,國藥準字H20140121,規格10 mg/片);6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)試劑盒(美國Sigma);TUNEL試劑盒(美國Promega);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);蛋白一抗(美國Abcam)。

1.3 PDD模型的構建

采用6-OHDA紋狀體雙靶點注射法及慢性不可預見性溫和應激法(chronic unpredictable mild stress,CUMS)制備PDD大鼠模型[6],具體操作如下:腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,并將大鼠頭顱固定于腦立體定位儀,去毛備皮,沿正中矢狀線剪開頭皮,暴露前囟,確定右側紋狀體注射點,于相應位點處顱骨鉆孔,再緩慢注入15 μg 6-OHDA,術后以醫用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合頭皮消毒,腹腔注射80000 U青霉素鈉抗感染,并注意保暖。術后6周時,背部皮下注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡,誘導大鼠向健側旋轉,注射10 min后觀察并記錄大鼠60 min內自然旋轉圈數,若旋轉≥6圈/min提示PD模型構建成功。取PD大鼠進行21 d CUMS,包括24 h禁食、24 h禁水、5 min水平搖晃、2 h閃光刺激、6 h潮濕鼠籠、5 min 50 ℃環境、5 min 4 ℃冷水游泳、24 h晝夜顛倒、1 min夾尾、10 s足底電擊,上述10種刺激隨機分配到21 d中,每天1種刺激,并避免同種刺激連續使用,通過行為學實驗評估PDD模型。

1.4 動物分組與處理

60只SD大鼠隨機分為5組:健康對照組、模型組(PDD組)、低、中、高劑量Aripiprazole處理組,每組12只。除健康對照組外,其余大鼠均構建PDD模型,健康對照組大鼠以生理鹽水進行外紋狀體雙靶點注射,不予以應激刺激。低、中、高劑量Aripiprazole處理組于建模后分別灌胃1.25、2.5、5 mg/kg Aripiprazole,1次/d,連續灌胃21 d[7]。健康對照組和PDD組以生理鹽水替代藥物灌胃。

1.5 大鼠行為學觀察

1.5.1 曠場實驗 將大鼠置于曠場反應箱正中心方格內,記錄5 min內大鼠的總移動路程及中心區域活動時間。

1.5.2 蔗糖溶液偏好實驗 實驗前3 d,除給予大鼠正常飲食外,予以1%糖水飼喂,且裝有糖水瓶和普通飲水瓶隨機調換位置,以便大鼠自由選擇飲用。適應性訓練結束后,禁水不禁食1 d,同時給予1%糖水和純水,12 h后更換水瓶位置,觀察并記錄大鼠24 h內兩種水的飲用量,計算蔗糖偏好指數(蔗糖水飲用量/總飲用水量×100%)。

1.5.3 Y迷宮實驗 將Y迷宮的3個臂隨機標記為A、B、C,將大鼠從交叉中心位放入,記錄大鼠5 min內自由探索進入3個臂的次序和進入臂總次數,若大鼠每次進入的臂與前兩次進入的不同則認定為正確選擇,統計犯錯次數和新異臂進入次數。

1.6 神經功能損傷評價

處理完成后,采用Longa法評價大鼠神經功能損傷情況,其中無神經功能缺失癥狀、活動正常為0分;提尾時健側不能完全伸展為1分;爬行時向健側轉圈行走為2分;行走時身體向健側傾倒為3分;無法自行行走、喪失意識、昏迷為4分。

1.7 腦組織5-HT和5-HIAA含量檢測

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,加入0.1 mol/L高氯酸勻漿,10000 r/min離心10 min,取上清檢測單胺類神經遞質及其代謝產物(5-HT、5-HIAA)的含量,具體操作參照試劑盒說明書。

1.8 大鼠腦組織損傷觀察

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,行常規石蠟切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察腦組織病理損傷。

1.9 大鼠腦組織細胞凋亡觀察

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,行常規石蠟切片,置于二甲苯中脫蠟,經磷酸鹽緩沖液洗滌后,添加TUNEL檢測試劑,避光條件下反應45 min,加入DAPI染劑孵育5 min,光鏡下觀察并拍照,計數染色陽性(凋亡)細胞數,計算凋亡陽性細胞數占比(凋亡指數)。

1.10 外周血代謝相關酶活性檢測

處理完成后,收集腹主動脈血,7500 r/min離心10 min,取上清采用比色法,測定血清LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.11 蛋白印跡法檢測凋亡和代謝相關蛋白的表達

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,加入適量液氮研磨,經蛋白裂解液提取總蛋白,各組取等量蛋白進行凝膠電泳,待蛋白完全分離后進行轉膜,再將轉以后的膜放入5%的脫脂奶粉中,搖床上室溫反應2 h,然后置于1∶1000一抗工作液中,4℃搖床反應過夜,次日置于1∶10000二抗工作液中,搖床上室溫反應1 h,最后添加化學發光劑,經凝膠成像及分析系統,檢測生存素(Survivin)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)、腺苷酸活化蛋白激酶α1(adenosine activated protein kinase α1,AMPKα1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)及葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)的相對表達量。

1.12 統計學方法

2.1 Aripiprazole對PDD大鼠抑郁樣行為的影響

與健康對照組比較,PDD組大鼠曠場移動路程、蔗糖偏好指數及新異臂進入次數均減少,犯錯次數增加(均P<0.05),表現出明顯抑郁樣行為;與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著提高曠場移動路程、蔗糖偏好指數及新異臂進入次數,降低犯錯次數(均P<0.05),見表1。

表1 Aripiprazole對PDD大鼠抑郁樣行為學的影響Table 1 Effects of Aripiprazole on depression-like behaviors in PDD

2.2 Aripiprazole對PDD大鼠腦神經損傷和腦內單胺類神經遞質的影響

如圖1,與健康對照組比較,PDD組大鼠腦神經功能損傷評分升高,腦組織5-HT、5-HIAA含量降低(均P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著降低腦神經功能缺損評分,并提高5-HT、5-HIAA含量(均P<0.05)。

A:腦神經功能評分,B:腦組織5-HT含量,C:腦組織5-HIAA含量;1:健康對照組,2:PDD組,3～5:低、中、高劑量Aripiprazole處理組;與健康對照組比較,*P<0.05;與PDD組比較,#P<0.05;n=6圖1 Aripiprazole改善PDD大鼠腦神經損傷和升高單胺類神經遞質水平Fig.1 Aripiprazole improves brain nerve damage and increases monoamine neurotransmitter level in PDD rats

2.3 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織病理損傷的影響

如圖2,健康對照組大鼠腦組織細胞結構完整、分布均勻,且無壞死細胞;模型組腦組織結構缺損、分布紊亂,且存在大量的壞死細胞;Aripiprazole處理后PDD大鼠腦組織病理損傷明顯減輕,其中以中、高劑量Aripiprazole處理組改善更為顯著。

1:健康對照組;2:PDD組;3～5:低(3)、中(4)、高(5)劑量Aripiprazole處理組圖2 Aripiprazole改善PDD大鼠腦組織病理損傷(HE染色,×400)Fig.2 Aripiprazole improves pathological damage in brain tissues of PDD rats(HE staining,×400)

2.4 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織細胞凋亡的影響

如圖3,健康對照組、模型組(PDD組)、低、中、高劑量Aripiprazole處理組腦組織細胞凋亡指數分別為(6.21±1.35)%、(52.37±9.51)%、(48.64±11.27)%、(36.72±6.57)%、(19.37±5.24)%。各組比較,差異有統計學意義(F=33.127,P<0.01);與健康對照組比較,PDD組大鼠腦組織細胞凋亡指數升高(P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著降低腦組織細胞凋亡指數(均P<0.05)。

2.5 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織中凋亡相關蛋白表達的影響

如圖4,與健康對照組比較,PDD組大鼠腦組織中Survivin表達降低,Bax/Bcl-2水平升高(均P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理組可顯著升高Survivin表達,并降低Bax/Bcl-2水平(均P<0.05)。

2.6 Aripiprazole對PDD大鼠血清代謝相關酶活性的影響

與健康對照組比較,PDD組大鼠血清LDH含量升高,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(均P<0.05)。

與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著降低血清LDH水平,并升高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(均P<0.05),見表2。

表2 Aripiprazole對PDD大鼠血清代謝相關酶活性的影響Table 2 Effects of Aripiprazole on activities of serum metabolism-related enzymes in PDD

2.7 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織中代謝相關通路的影響

如圖5,與健康對照組比較,PDD組大鼠腦組織中p-AMPKα1、PGC-1α及GLUT4表達降低(均P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著提高AMPKα1磷酸化水平以及PGC-1α和GLUT4的表達(均P<0.05)。

A:蛋白電泳條帶圖;B:各組p-AMPKα1/AMPKα1、PGC-1α及GLUT4表達的統計比較;1:健康對照組;2:PDD組;3～5:低、中、高劑量Aripiprazole處理組;與健康對照組比較,*P<0.05;與PDD組比較,#P<0.05;n=6圖5 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織中代謝相關通路的影響Fig.5 Effects of Aripiprazole on metabolism-related pathways in brain tissues of PDD rats

本研究應用曠場實驗、蔗糖溶液偏好實驗及Y迷宮實驗,反映大鼠情緒,發現PDD大鼠表現出明顯的抑郁樣行為學改變,且存在運動障礙;經中、高濃度Aripiprazole處理后,蔗糖偏好指數及新異臂進入次數的增加和犯錯次數的減少,說明Aripiprazole可改善PDD大鼠模型的抑郁情緒,這與Yoon等[8]臨床研究結果基本相符。

單胺類遞質假說是研究最多最深入的抑郁癥發病機制之一,腦內多巴胺、5-HT、去甲腎上腺素等神經遞質及受體失調,引起海馬、皮層等調節情緒腦區結構和功能的改變,最終導致抑郁癥的發生[9]。而PD由于黑質內多巴胺能神經元缺失,降低多巴胺釋放,從而引起多巴胺遞質系統與乙酰膽堿系統失調,不僅引起肌張力增高、運動減少等運動癥狀,還會出現抑郁癥。單胺類神經遞質5-HT主要參與情緒、體溫、認知等功能的調節,其腦內含量與抑郁癥的病情密切相關,多數臨床一線抗抑郁藥物主要靶向5-HT系統,從而達到抗抑郁的作用[10]。本研究顯示,遭受應激刺激的大鼠腦組織神經功能出現明顯損傷,腦內5-HT及其代謝產物5-HIAA含量明顯降低,經中、高劑量Aripiprazole治療后,腦神經功能損傷明顯減輕,5-HT和5-HIAA含量明顯增加,提示Aripiprazole對PDD大鼠的抗抑郁作用機制可能與影響腦內5-HT能神經系統,增加5-HT和5-HIAA含量有關。

既往對PD患者的臨床病理學研究、基礎研究均表明,腦內細胞凋亡與PD密切相關[11-12]。當腦組織結構和功能發生改變時,往往伴隨著神經細胞損傷,這與抑郁癥狀、認知功能障礙的發生也存在聯系[13]。TUNEL染色發現,PDD大鼠腦組織細胞凋亡指數顯著上升,提示腦組織細胞凋亡是PDD大鼠腦功能損傷的重要表現。體內細胞凋亡過程受多種途徑的共同調控,其中線粒體途徑主要通過調節Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax比例,影響線粒體通透性,最終激活下游半胱天冬酶家族級聯反應[14]。Survivin是一種強效的抗凋亡因子,可介導半胱天冬酶家族抑制細胞凋亡過程,并增強細胞增殖的潛能[15]。本研究中,Aripiprazole治療可提高PDD大鼠腦組織中Survivin表達,并降低Bax/Bcl-2水平,表明Aripiprazole可能通過抑制腦組織細胞的凋亡,保護PDD大鼠的腦損傷,這與kim等[16]研究報道Aripiprazole在缺血性卒中后抑郁小鼠中的抗凋亡作用一致。

腦能量代謝異常常見于PD、腦缺血、腦挫裂傷等。研究證實,抑郁癥患者腦內可出現明顯的能量代謝紊亂,提示能量代謝損傷可能是抑郁癥臨床癥狀的神經生物學基礎[17]。LDH是機體糖無氧酵解的重要指標,可敏感反映體內能量代謝情況[18]。ATP作為主要的能量物質,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是參與主動轉運離子泵的核心成分,可維持細胞內外的離子交換,也是代謝紊亂及組織損傷的標記物[19]。AMPK/PGC-1α是重要的能量代謝信號調控通路,AMPK亞基AMPKα1活化狀態可啟動PGC-1α,增加GLUT4表達,促進葡萄糖的攝取[20]。本研究結果顯示,血清LDH含量升高,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力及腦組織p-AMPKα1/AMPKα1、PGC-1α及GLUT4表達降低可能與PDD大鼠抑郁行為變化有關,Aripiprazole可降低LDH水平,提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力,p-AMPKα1/AMPKα1、PGC-1α及GLUT4的表達,改善模型大鼠腦內能量代謝,這可能是Aripiprazole在PDD大鼠中抗抑郁作用的重要分子機制。

綜上所述,阿立哌唑可改善帕金森病抑郁癥大鼠抑郁樣行為,其機制可能與增加單胺類神經遞質、抑制腦組織細胞凋亡、改善能量代謝有關。但阿立哌唑是否存在其他的作用途徑改善PDD癥狀,仍有待進一步研究明確。