人卵母細胞生長發育調控機制的研究進展

王麗娜 王海

人卵母細胞生長、發育是一個錯綜復雜的生理、生化演變過程，經歷了卵原細胞、初級卵母細胞、次級卵母細胞和成熟卵母細胞4 個生長發育階段。初級卵母細胞經過第一次減數分裂，排出第一極體，成為次級卵母細胞。次級卵母細胞經過第二次減數分裂，發育成為成熟卵母細胞，即MⅡ[1]。這兩次成熟分裂能整合多種信號和諸多因子，這些信號通路和諸多因子構成了卵母細胞生長發育的調控網絡。盡管如此，一些機制仍不清楚，一些信號通路仍未發現，參與這一過程的細胞因子功能和作用尚未被完全證實。故深入研究人類卵母細胞生長、發育及這一過程中的生理調控機制，對人類生殖醫學及其臨床應用方面具有重要意義。

卵原細胞沒有“住”在卵泡內，當雌性胚胎發育到8～10 周齡時，性腺組織出現卵巢結構，遷移到卵巢的原始生殖細胞通過有絲分裂進行增殖。到妊娠12 周齡時，胎兒卵巢內的生殖細胞達到60 000個子細胞，這些細胞稱之為卵原細胞。

而初級卵母細胞“住”在卵泡內，從妊娠16 周齡開始，卵原細胞失去了進一步增殖有絲分裂能力，開始了第一次減數分裂，此時細胞稱為初級卵母細胞，這些細胞僅發育到第一次減數分裂前期的雙線期就停滯下來。與此同時，這些初級卵母細胞與其周圍單層扁平的顆粒細胞被一薄基底膜包裹，形成原始卵泡[2]。當胎兒20～24 周齡時，幾乎所有的卵原細胞全部發育到第一次減數分裂的前期雙線期，約為600 萬～700 萬個。卵原細胞長期停滯在第一次減數分裂前期雙線期，直到青春期受性激素的刺激時才恢復減數分裂，短者需要12年后恢復，長者需要50 年。盡管初級卵母細胞核停滯在分裂前期雙線期，但并沒有停止生長，卵母細胞隨著卵泡生長而生長，卵胞質內的物質在不斷地積累和豐富。

卵泡的發育與卵母細胞生長相對應，通過觀測卵泡的發育可以推測卵母細胞生長階段。初級卵泡到早期三級卵泡階段獨立于FSH 刺激，主要通過旁分泌和自分泌方式進行生長發育[3]。卵泡發育到有腔卵泡階段，FSH 可促進卵泡發育，經過選擇，只有一個卵泡發育生長成優勢卵泡，在促性腺激素LH 作用前，卵母細胞一直滯留在生發泡（GV）階段。卵母細胞的發育能力是在卵泡生長、發育過程中逐漸獲得的[4]：①卵泡直徑超過5mm，卵母細胞具備了發生GVBD 的能力；
②卵泡直徑超過8mm，卵母細胞具備發育到MⅡ的能力；
③卵泡直徑超過11mm，卵母細胞具備了維持早期胚胎發育的能力；
④卵泡直徑超過14mm，卵母細胞核、質均成熟，在LH 作用下，恢復減數分裂Ⅰ，發育到減數分裂Ⅱ中期，即MⅡ，此時卵母細胞具備了受精和維持胚胎全程發育的能力（圖1，出自參考文獻4）。

圖1 體內卵泡和卵母細胞發育階段的相互關系

卵母細胞由初級卵母細胞分裂變成次級卵母細胞的過程中，卵母細胞停滯于第一次減數分裂前期雙線期，即GV 期，但這種停滯的確切分子機理至今仍未完全清楚，這種停滯狀態可能受激素、大量調節因子和多條信號通路等多種因素影響，目前認為這種減數分裂的活動停滯是由來自卵泡內膜、顆粒細胞和卵泡液的多種抑制物共同作用的結果，有些抑制物主要通過縫隙連接進入卵母細胞內起作用（圖2A、B）。

圖2 卵母細胞減數分裂I 停滯與恢復的信號通路

目前，抑制卵母細胞減數分裂的抑制物（Oocyte maturation inhibitor，OMI）尚未完全清楚，推測是一些肽類分子（如轉化生長因子，TGF-）、抗苗勒氏管激素（AMH）、激活素、抑制素或卵泡抑制素、卵泡液中的次黃嘌呤和環磷酸腺苷（cAMP）[5]等，在這些抑制物中，研究較多且比較清楚的是cAMP。

目前，認為維持卵母細胞減數分裂Ⅰ雙線期停滯狀態主要是通過維持卵母細胞內cAMP 高水平來實現的[6]。cAMP 進入卵母細胞后，維持成熟促進因子（Maturation promoting factor，MPF）的非活性狀態，失活的MPF 導致卵母細胞阻滯在第一次減數分裂Ⅰ前期的雙線期，直到LH 峰的出現。cAMP有兩個來源：一個是顆粒細胞合成的cAMP，通過縫隙連接擴散到卵母細胞內（圖2A）：另一個是哺乳動物卵母細胞本身能夠產生足夠多的cAMP[7]。顆粒細胞cAMP 產生過程：配體與G 蛋白偶聯受體（GPCR）結合，導致Gs 蛋白激活，進而激活顆粒細胞中腺苷環化酶（AC），在AC 的作用下，促使三磷酸腺苷（ATP）轉變成cAMP，cAMP 通過顆粒細胞和卵母細胞之間的縫隙連接轉移到卵母細胞內[8]。在卵母細胞內，同樣Gs 通過表達在卵母細胞膜表面的G 蛋白偶聯受體的激活，刺激AC 合成內源性cAMP（圖2B），顆粒細胞源源不斷地輸送cAMP 到卵母細胞內和卵母細胞自身產生cAMP，維持著卵母細胞的cAMP 高水平狀態。另外，顆粒細胞生成的cGMP 通過縫隙連接進入卵母細胞內，cGMP 降低卵母細胞內PDE3 活性，減少cAMP 降解，進一步維持卵母細胞內cAMP 高濃度狀態，抑制減數分裂Ⅰ的恢復（圖2B）。

cAMP 通過cAMP-PKA-MPF 信號途徑發揮作用。MPF 是一種復雜的異源二聚體，由一個催化亞基CDKI 和調控亞基CyclinB1 組成，CDK1 激酶是一個維持或誘導卵母細胞減數分裂Ⅰ停滯與恢復的中心因子[9]。胞質內高水平cAMP 通過cAMPPKA-MPF 信號途徑，促使Cdc25 失活，激活Wee1/Myt1?；罨腤ee1/Myt1 促使MPF 的催化亞基CDKI 上的絲氨酸及蘇氨酸殘基磷酸化，Thr-14、Tyr-15 和Thr-161 三個氨基酸位點被磷酸化，其中，Thr-14 和Tyr-15 位點磷酸化有抑制MPF 活性的作用，而Thr-161 位上點磷酸化是MPF 活性的必需條件。磷酸化的CDKI 與調控亞基cyclinB 結合，致使MPF 處于穩定、無活性狀態，從而使卵母細胞停滯在減數分裂Ⅰ前期的雙線期[10]?？梢?，MPF 處于無活性狀態是減數分裂Ⅰ停滯于雙線期的關鍵因素（圖2B）。

卵母細胞停滯于第一次減數分裂前期雙線期，細胞核處于相對靜止狀態，但卵母細胞本身和它所在的卵泡生長并未停止。卵泡體積在增大，卵泡液內的物質在不斷積累。隨著卵泡的生長發育，卵母細胞體積隨之增大，胞漿內物質更為豐富，當卵母細胞直徑達到95～120μm 時[11]，具備了生發泡破裂（Germinal vesicle break down，GVBD）的能力。GVBD 是減數分裂Ⅰ恢復的形態學標志。

在自然情況下，卵母細胞恢復減數分裂Ⅰ，必須具備以下條件：①卵泡直徑>5mm[4]；
②卵母細胞體積達到成熟體積的80%以上[11]；
③促性腺激素的誘導。具備了前兩個條件，在促性腺激素LH 的誘導下，才能啟動停滯于雙線期的減數分裂Ⅰ。卵母細胞從胚胎期到青春期前，維持減數分裂Ⅰ停滯狀態，普遍認為主要是通過保持cAMP 高濃度來實現的。卵母細胞內cAMP 濃度主要是由顆粒細胞進入卵母細胞內的cAMP 和卵母細胞自身生成/降解cAMP 來維持的。當減數分裂Ⅰ處于停滯狀態，三者保持動態平衡，維持卵母細胞內cAMP 高水平狀態。一旦在某些因素影響下，三者平衡被打破，卵母細胞內cAMP 的濃度下降，PKA 信號途徑失活，導致Cdc25 活性上升，促使Cdk1 上的Thr14 和Tyr15 去磷酸化，激活MPF，激活的MPF 啟動了停滯于雙線期的減數分裂Ⅰ。在促性腺激素LH 作用下，降低cAMP 濃度的途徑包括：

3.1 LH 提高PDE 活性，降低顆粒細胞和卵母細胞內cAMP 水平PDE 蛋白家族有著多種不同亞型，一種專門負責降解第二信使cAMP 和cGMP 的酶。在顆粒細胞內主要存在著PDE4，在卵母細胞內主要存在著PDE3。

在顆粒細胞中，LH 峰出現，細胞內Ca2+儲存的釋放，激活了蛋白激酶C（PKC）信號途徑，提高了顆粒細胞內PDE4 活性，促使cAMP 水解，使從顆粒細胞進入卵母細胞內的cAMP 減少。

Norris 等研究發現，LH 峰的出現降低了卵泡壁層顆粒細胞內NPPC 的含量和卵丘細胞上NPR2 的活性，造成cGMP 合成減少（cGMP 是PDE3 的競爭性抑制劑），從顆粒細胞進入卵母細胞內的cGMP 相應的減少，降低了cGMP 對磷酸二酯酶PDE3 活性的抑制效應，致使PDE3 活性增強，導致卵母細胞內cAMP 水平下降[12，13]。

Xi 等[14]進一步發現，LH 依賴EGFR-ERK1/2信號通路，激活轉錄因子EGR1 的表達和ELK1的磷酸化，從而迅速上調卵泡壁層顆粒細胞中的TTP 蛋白水平。TTP 蛋白通過靶向至NPPC mRNA 3’UTR 區域獨特的非經典AU 富集元件（noncanonical ARE），引發NPPC mRNA 快速降解和C-型鈉肽快速下降，提高卵母細胞中PDE3A 的活性，降低卵母細胞中cAMP 水平，從而保證卵子減數分裂重新啟動的正常進行。

總之，在LH 作用下，PDE4、PDE3 活性增強，降低了顆粒細胞、卵母細胞內cAMP 水平，致使PKA 信號途徑失活，激活cdc25 磷酸酶，使MPF 去磷酸化激活，卵母細胞啟動減數分裂Ⅰ（圖2C）。

3.2 LH 激活MOS-MEK-MAPK 信號途徑LH 激活MOS-MEK-MAPK 信號途徑，促使cAMP 降解，引起顆粒細胞與卵母細胞縫隙連接的阻斷在卵母細胞內，LH 誘導MOS 水平升高（MOS 是原癌基因c-mos 的產物，是生殖細胞特異性Ser/Thr 激酶）[15]，MOS 誘導MEK 磷酸化并由此產生活性，然后MEK激活MAPK 信號通路，促使cAMP 降解。有報道在牛的卵母細胞成熟過程中，向胞質內注射MOS 的mRNA，激活了MAPK，引發cAMP 水平下降和減數分裂啟動[16]。同樣，在顆粒細胞內，存在的MOSMEK-MAPK 信號途徑被LH 激活后，促使顆粒細胞內的 cAMP 降解，從顆粒細胞進入卵母細胞內的cAMP 相應地減少（圖2C）?？梢?，MAPK 信號途徑是卵母細胞減數分裂Ⅰ恢復的關鍵因素之一。

LH 激活MOS-MEK-MAPK 信號途徑，誘導Cx43 上的絲氨酸殘基磷酸化[17]，磷酸化Cx43 阻斷了卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙連接，致使外部的cAMP 無法進入卵母細胞。同樣，阻止了cGMP進入卵母細胞，cGMP 濃度下降導致了PDE3 活性恢復，促進cAMP 水解[18]。實驗證明，在大鼠卵泡培養中添加LH，間隙連接蛋白CX43 磷酸化，使卵母細胞發生GVBD[19]。

3.3 LH 激活PLC-IP3/DAG-PKC 信號途徑，降低卵母細胞內cAMP 水平在LH 作用下，磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）分解產生肌醇三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）兩個第二信使分子，二者有著不同信號途徑的重要第二信使，也是合成其他重要信號分子的底物。IP3 作為可溶性結構釋放到胞質溶膠中，與內質網膜上專一的IP3 受體（IP3 receptor）結合，使IP3-門控Ca2+通道打開，使Ca2+從內質網釋放出來，進入細胞質內，導致細胞質中Ca2+濃度增加[20～23]。Ca2+和DAG 一起激活PKC，提高PDE 活性，促使cAMP 降解，卵母細胞內cAMP 水平隨之下降（圖2C）。

卵母細胞恢復減數分裂Ⅰ，完成減數分裂Ⅰ后，就停滯在減數分裂Ⅱ中期（MⅡ）。MⅡ的停滯有助于卵母細胞的核質成熟同步化，等待受精，是哺乳動物在進化過程中獲得的一種重要生理機制。MⅡ停滯是以維持高活性MPF 和中期紡錘體穩定為特征，但卵母細胞為何會停滯在MⅡ仍處于探索和研究之中。目前認為這種停滯主要依賴靜止因子（Cytostatic factor，CSF），CSF 不是一種特定因子，而是多種蛋白激酶復合物，迄今為止還沒有完全認識CSF?，F在已知的信號途徑參與MⅡ停滯見圖3。其中Mos-MEK-MAPK-Rsk 信號途徑是CSF 不可缺少的成分，科學家們把上游的Mos 和下游的Rsk注射到二細胞胚胎卵裂球，均會導致細胞分裂停滯在中期。

圖3 Mos-MAPK 通路和EmiZ-APC/C 通路維持卵母細胞MⅡ穩定性

進一步研究表明Mos-MEK-MAPK-Rsk 通路是通過阻止CyclinB 降解，激活和維持MPF 處于高活性狀態，來阻止MⅡ卵母細胞進一步發育[24]。同時，MAPK 激活MISS（MAPK-interacting and spindlestabilizing protein）和DOC1R（Deleted in oral cancer-1 related），活化的MISS 和DOC1R 對紡錘體有穩定作用。MISS 或DOC1R 缺失將會導致微管星體的延長，或導致MⅡ期紡錘體紊亂，通常表現為紡錘體兩極中的一極缺失。

EmiZ（Endogenous meiotic inhibitor Z）也是CSF的成分之一，通過抑制APC/C（Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome）的活性，致使CyclinB 累積，致使MPF 處于高活性狀態，阻止MⅡ向后期轉變[25]。當精子遇到卵子發生頂體反應后，CSF 的活性隨著卵母細胞受精而消失[26]。同樣，MPF 的活性是在受精后1.5h 完全消失，其活性下降過程與卵母細胞第二次減數分裂恢復的過程同步。

成熟卵母細胞是指能接受精子受精并能形成正常發育胚胎的卵母細胞。不同種類動物卵母細胞是在不同發育階段達到該狀態，有的是在GV 破裂之前，即處于初級卵母細胞時期，如蛔蟲、箭蟲；
有的處于減數分裂Ⅰ中期，如貽貝、玻璃海鞘；
有的是在減數分裂Ⅱ中期（MⅡ），如絕大多數脊椎動物；
有的已完成二次成熟分裂，如腔腸動物。人的成熟卵母細胞是在MⅡ，此時卵母細胞能接受精子受精并能形成正常發育胚胎。

卵母細胞成熟是一個復雜過程，包括核成熟和卵胞質成熟，這兩個方面相輔相成，任何一方出現問題都會影響卵母細胞成熟和進一步受精和發育。

5.1 卵母細胞的核成熟人卵母細胞成熟起始于胚胎期，完成于性成熟后。卵母細胞核成熟在形態學上的標志表現為GVBD 和第一極體（The first polar body，PBI）排出。

當胎兒發育到24 周齡時，幾乎所有的卵原細胞進入第一次減數分裂，成為初級卵母細胞。初級卵母細胞經細線期、偶線期、粗線期發育到雙線期，在此停滯發育，并與原始顆粒細胞相互作用形成了原始的卵泡。初級卵母細胞停滯在雙線期長達十幾年到五十多年。此時，細胞核較大，稱之為GV，GV 有一層清晰、完整的核膜包裹著，在其內部靠近核膜有一核仁。

從原始卵泡階段的卵母細胞到早期有腔卵泡階段的卵母細胞，其核功能逐漸被激活。染色質解聚呈高度疏松狀，核膜和核仁清晰可見（核仁是由致密纖維組分、纖維中心和顆粒組分構成的纖維網狀結構，其間有許多空泡，空泡可能與核仁物質運輸和貯存有關），待空泡逐漸消失，核仁也逐漸致密化，核糖體RNA（rRNA）在核仁中合成、儲存[27]。核仁完全致密化、核仁周圍有染色質相伴分布是減數分裂恢復的必要條件[28，29]。

青春期后，在促性腺激素調控下，染色體擴散，高度凝集在核膜內緣，核孔復合體隨之消失，隨后發生核膜破裂，核內物質與胞質混合，此過程被稱為GVBD，標志著減數分裂Ⅰ恢復。當排出第一極體，卵母細胞完成了第一次減數分裂，很快進入減數分裂Ⅱ，并停滯在MⅡ期，至此卵母細胞完成核成熟。核成熟的卵母細胞內藴藏著大量與受精和胚胎發育分化相關的信息。

5.2 卵母細胞的胞質成熟在卵母細胞完成核成熟的過程中，細胞質隨之發生許多與成熟相關的變化，但胞質成熟形態改變不像核成熟那樣明顯且易觀察。目前，學術界認為細胞質成熟主要包括：皮質顆粒的增多與遷移、各種細胞器遷移與分布以及卵膜和透明帶之間的變化等，這些變化被作為衡量細胞質成熟的指標。

5.2.1 皮質顆粒（Cortical granules，CGs）的變化 在卵母細胞成熟的過程中，皮質顆粒數量在不斷增加，分布也在發生規律性變化。皮質顆粒的合成是個持續的過程，但高爾基體合成、分泌皮質顆粒呈現出兩個高峰期：第1 次發生在小腔卵泡的卵母細胞內；
第2 次發生在即將恢復減數分裂Ⅰ的卵母細胞內[30，31]。在卵母細胞成熟過程中，一方面高爾基體在不停地合成皮質顆粒，與此同時皮質顆粒向卵子邊緣遷移；
另一方面隨著卵母細胞成熟，高爾基體在逐漸消失，成熟的卵子內沒有高爾基體，表明成熟的卵子已完成了皮質顆粒細胞合成。按照皮質顆粒遷移的規律而言，未成熟卵母細胞的CGs 主要分布在皮質區，而成熟卵母細胞的CGs 是在質膜下呈單層排列[31，32]。由此可見，皮質顆粒數量增加、在質膜下單層排列是評定卵母細胞胞質成熟的指標之一。

5.2.2 細胞器的變化 在卵母細胞成熟過程中，卵母細胞內的細胞器遷移和重新分布最為顯著。隨著卵母細胞胞質的成熟，線粒體、高爾基體、粗面內質網等細胞器由皮質層向中央區遷移。線粒體不斷地增多，線粒體簇變大，著色變深，線粒體在卵胞質內呈均勻分布，如果線粒體仍在卵母細胞周邊分布，其發育潛能較低，可見線粒體遷移與重新分布影響著卵母細胞的胞質成熟[33～35]。粗面內質網最早出現在小腔卵泡的卵母細胞中，卵母細胞成熟后，粗面內質網消失，但滑面內質網增多，其囊池膨大，形態不規則，與線粒體緊密相連。高爾基體連續合成、分泌皮質顆粒，同時高爾基體在逐漸消失，當卵母細胞成熟后高爾基體基本上完全消失[32]。高爾基體消失意味著皮質顆粒合成完成，卵母細胞做好了受精的準備。

5.2.3 卵膜和透明帶之間卵周隙的變化 卵周隙是卵胞質成熟的指標之一。在未成熟的卵母細胞中，卵周隙尚未形成，在卵膜表面有大量的微絨毛分布，并且垂直植入透明帶內。隨著卵母細胞成熟，卵膜和透明帶之間空隙逐漸擴大，微絨毛數量減少并逐漸從透明帶中撤出，全部倒伏在卵膜表面，這時卵膜和透明帶之間的腔隙稱為卵周隙。正常成熟的卵母細胞，卵周隙距離適中，能在卵周隙內清晰地看到第一極體。如果卵周隙過小，說明極體剛剛釋放，卵子成熟欠佳；
卵周隙越大，說明卵母細胞質量越差，這是由于細胞質過度收縮造成的。細胞質過度收縮可能有兩個原因，一是卵子過度成熟導致胞漿皺縮，造成卵周隙變大：二是第一極體排出時伴隨大量的糖蛋白釋放，造成卵周隙變大。卵周隙大小對受精影響不大，但對其后期發育影響較大。

卵母細胞發育是一個從形態學到內部細胞學以及分子、蛋白、信號通路動態變化的過程，各個組成成分相互作用，構成了卵母細胞發育調控網絡，但兩次減數分裂是卵母細胞發育調控的主干網絡。隨著研究的不斷深入，許多信號通路在卵母細胞生長發育過程中所起的作用越來越清晰，但還有哪些信號通路涉及到卵母細胞生長發育，以及信號轉導途徑中又有哪些下游靶基因參與等相關的問題仍未解決。因此，深入研究卵母細胞生長發育的調控機制，有助于逐步提高卵母細胞成熟的核、質成熟同步化，對于治療卵源性不孕疾病有著重要意義。