tva受體基因起始密碼子突變對雞感染A亞群禽白血病病毒的影響

陳偉國，鄺智祥，張翔宇，李文雪，徐慧娟，朱學鳳，謝青梅

(1華南農業大學動物科學學院/廣東省畜禽健康養殖與環境控制重點實驗室,廣東 廣州 510642；
2廣東愛健康生物科技有限公司,廣東 清遠 511800)

禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukemia virus，ALV)引起的一類禽免疫抑制性腫瘤性傳染病?？勺匀桓腥倦u群的禽白血病病毒包括ALVA～E、J和K 7個亞群，其中ALV-A是引起我國雞群發生禽白血病的主要病原[1-2]。ALV-A可使感染雞群產生免疫抑制、生產性能下降，乃至發生特征性腫瘤而死亡，給養禽業造成巨大的經濟損失[3-4]。目前，該病鮮有商品化疫苗和有效的治療方法，主要通過凈化種群和生物安全措施進行預防[5]。然而，近年來禽白血病的流行病學調查研究發現，ALV-A在我國地方雞種[6-7]、商品肉雞[8]、蛋雞[9]及野生鳥類[10]中普遍存在?？梢?，現有措施并不能完全控制A亞群禽白血病在中國的發生與流行，該病已成為威脅我國養雞業(尤其是種雞業)可持續健康發展的重大疾病之一。因此，研發更適合防控我國A亞群禽白血病的新策略已迫在眉睫。國外已有研究證實，提高宿主對A亞群禽白血病的遺傳抗性，開展A亞群禽白血病的抗病育種可成為防控該病的有效策略[11-13]。

ALV-A由tva受體基因編碼的細胞表面特異性受體Tva介導侵入宿主細胞，繼而發生感染[14]。tva受體基因的遺傳突變會導致Tva受體蛋白的完全缺失或表達一個不適宜作為ALV-A受體的缺陷型Tva受體蛋白，從而引起宿主細胞對ALV-A的感染產生遺傳抗性[15]。在國外白來航近交品系tva受體基因中已經鑒定了tvar1、tvar2、tvar3和tvar44個ALV-A遺傳抗性位點[16-17]。Chen等[18]首次從中國雞種中成功鑒定了tvar5和tvar62個ALV-A遺傳抗性位點。另外，我們前期研究(未發表)發現中國雞種tva受體基因存在新的自然突變位點：tva基因編碼區第3位堿基由G突變為A，推測該突變引起tva基因起始密碼子序列由ATG突變為ATA，將該tva基因自然突變命名為tva c.3G>A，但其對宿主感染A亞群禽白血病病毒的影響尚不清楚。因此，本研究擬通過ALV-A體外感染試驗和體內攻毒試驗，從體外、體內2個層面驗證tva c.3G>A突變是否引起宿主對ALV-A的感染產生遺傳抗性，以期鑒定新的ALV-A遺傳抗性位點。

1.1 試驗動物、病毒、細胞株及質粒

黃羽肉雞品系CB01～CB15[19]抗凝血樣采自于溫氏食品集團股份有限公司，每個品系隨機采取36～60份血樣，共670份血液樣品。1日齡無特定病原(Specific pathogen free，SPF)雞苗購自廣東大華農有限公司。ALV-A GD08株、DF-1細胞系為廣東省畜禽健康養殖與環境控制重點實驗室保存。RCASBP(A)-GFP重組質粒為廣東省畜禽健康養殖與環境控制重點實驗室前期構建并保存[18]。

1.2 主要試劑

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；
質粒小量提取試劑盒、無內毒素質粒大量提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒均購自OMEGA公司；
ReverTra Ace?qPCR RT Kit、KOD-FX購自Toyobo公司；
FastStart SYBR Green Master(Rox)購自Roche公司；
反轉錄試劑盒、pMD19-T、PrimeScript?One Step RT-PCR Kit購自Takara公司；
Opti-DM EM無血清培養基、DMEM細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素均購自Gibco公司；
TRIZOL reagent、Lipofectamine 3000轉染試劑購自Invitrogen公司。

1.3 黃羽肉雞品系tva基因的遺傳變異分析

參考NCBI數據庫中雞tva基因的DNA序列(GenBank登錄號：AY531262.1)，應用Primer 5.0軟件設計3對引物，分3個片段(1、2和3段)PCR擴增tva基因全長序列3 607 bp，引物信息見表1。提取黃羽肉雞品系CB01～CB15血液樣品的基因組DNA，用該3對引物PCR擴增tva基因全長序列。將PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，應用DNAstar和Mutation Surveyor基因序列分析軟件比對tva基因序列和測序序列，分析黃羽肉雞品系tva基因的遺傳變異，對tva c.3G>A突變位點進行基因分型。

表1 tva受體基因全長序列PCR擴增引物信息Table 1 Primers used to amplify the whole sequence of tva receptor gene

1.4 tva基因mRNA的RT-PCR擴增

采用Trizol法提取tva c.3G>A突變位點野生型tva c.3G/G和純合突變型tva c.3A/A種雞血液的總RNA，參考反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA。參考文獻[18]中的引物序列和PCR反應體系、擴增條件，利用KOD-FX高保真酶RTPCR擴增tva基因整個編碼序列?；厥?、純化的RT-PCR產物克隆入pMD 19-T，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果應用Lasergene 7.1軟件進行分析。

1.5 雞胚成纖維細胞分離與培養

采集10日齡雞胚消毒后，用鑷子打開氣室和殼膜，夾起雞胚，用眼科剪刀和鑷子剔除頭、爪、骨頭和內臟，把雞胚組織塊置于平皿中，用PBS液漂洗去除血污。將漂洗好的組織塊放入5 m L離心管，用眼科剪刀剪至肉糜狀，用0.25%(w)的胰酶在37℃水浴箱中消化15～20min，加入適量的小牛血清終止消化。使用200目細胞濾膜過濾后，1 000 r/min離心5min，棄掉上清液，用完全培養基對細胞進行重懸，分裝入無菌培養皿中，獲取純化的雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)，細胞置于CO2體積分數為5%、37℃的培養箱內培養。

1.6 流式細胞術檢測RCASBP(A)-GFP報告病毒感染

將重組質粒RCASBP(A)-EGFP轉染入DF-1細胞中，轉染后第7天，拯救并收集DF-1細胞上清液中表達綠色熒光蛋白的重組病毒RCASBP(A)-GFP，測定病毒感染單位(IU)后，分裝保存于?80℃備用。分離與培養tva c.3G>A突變位點野生型tva c.3G/G、雜合突變型tva c.3G/A和純合突變型tva c.3A/A CEF，分別接種于24孔板中，每孔接種5×104個細胞，培養24 h后，每孔接種5×105IU/m L的RCASBP(A)-GFP病毒液。孵育2 h后，棄掉病毒液，用含1%(φ)胎牛血清的維持液繼續培養。感染后第1、2、3、7天，使用Cytomics FC 500分析儀(Beckman Coulter，USA)通過熒光激活細胞分選(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)定量tva c.3G>A突變位點不同基因型CEF的GFP陽性細胞百分比。

1.7 ALV-A體內感染試驗

前期研究發現tva c.3G>A突變主要存在于CB06品系。從CB06品系隨機挑選75只1日齡雛雞隨機分為3組，每組25只商品雞和3只SPF雞作為對照，飼養于3個隔離器，并隨意提供飼料和水。1日齡時，每只雛雞腹腔接種ALV-A GD08株病毒液(S/P=2.1)0.2m L，5日齡時，再攻毒1次。攻毒后1周，采集每只雛雞抗凝血樣，抽取全基因組DNA，通過直接測序方法對每只雛雞tva c.3G>A突變位點進行基因分型。攻毒后1個月，采集雛雞的血樣，利用Trizol試劑盒抽提血樣總RNA，利用ALV-A GD08株特異性檢測引物，RT-PCR檢測每只雛雞的病毒血癥情況，確定tva c.3G>A突變不同基因型雛雞對ALV-A GD08株的感染狀態[18]。

1.8 統計分析

所有數據均使用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖和數據統計分析，2組數據比較采用獨立樣本t檢驗分析，數據結果以平均值±標準差表示。利用Popgene軟件分析tva c.3G>A突變位點在我國黃羽肉雞品系中的基因型頻率分布。

2.1 黃羽肉雞品系中tva c.3G>A突變位點的鑒定

為了剖析中國黃羽肉雞品系tva受體基因的遺傳變異，分3個片段PCR擴增每只雞tva受體基因的基因組區域。如圖1所示，PCR擴增出tva基因的1、2和3片段的目的條帶，片段大小與預期結果相符。將PCR產物進行Sanger測序，發現中國黃羽肉雞品系tva基因DNA序列第260位堿基存在由G突變為A的自然突變(圖2)，進一步分析推測該突變致使tva基因編碼區第3位堿基由G突變為A，引起tva基因起始密碼子序列由ATG突變為ATA，將該tva基因自然突變命名為tva c.3G>A。為了證實純合突變型tva c.3A/A轉錄本存在G>A突變，RT-PCR擴增野生型tva c.3G/G和純合突變型tva c.3A/A血液tva基因整個編碼序列。結果如圖3所示，tva c.3G/G和tva c.3A/A基因型血樣均擴增出566和420 bp的條帶，表明tva c.3G>A突變位點在不同基因型血樣均可擴增出tva基因長、短2個轉錄本。RT-PCR產物的克隆測序結果表明，與野生型tva c.3G/G相比，純合突變型tva c.3A/A基因型2個tva cDNA序列第3位堿基均由G突變為A，引起Tva受體蛋白氨基酸序列第1個氨基酸由甲硫氨酸(M)改變為異亮氨酸(I)。

圖1 tva基因3個片段的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplified results of three fragments of tva gene

圖2 tva c.3G>A突變位點不同基因型測序圖Fig.2 Sequence traces for tva c.3G>A mutation sites of different genotypes

圖3 tva c.3G>A突變位點不同基因型血樣全長tva編碼序列的RT-PCR擴增結果Fig.3 RT-PCR amplified results of the full-length tva coding sequences for blood samples from different genotypes of tva c.3G>A mutation site

2.2 tva c.3G>A突變致宿主體外抗ALV-A感染

RCASBP(A)-EGFP重組質粒轉染DF-1細胞48 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察到GFP熒光標記蛋白表達，表明成功拯救了RCASBP(A)-GFP熒光報告病毒(圖4)。為探究tva c.3G>A突變對宿主細胞體外感染ALV-A的影響，利用拯救的RCASBP(A)-GFP熒光報告病毒分別感染tva c.3G/G、tva c.3G/A和tva c.3A/A CEF，感染后不同時間點利用流式細胞術檢測RCASBP(A)-GFP對tva c.3G>A突變位點不同基因型CEF的感染情況，結果如圖5和6所示。野生型tva c.3G/G CEF和雜合突變型tva c.3G/A CEF對RCASBP(A)-GFP病毒易感，而純合突變型tva c.3A/A CEF抗RCASBP(A)-GFP的感染，表明tva c.3G>A突變導致宿主體外抗RCASBP(A)-GFP的感染。

圖4 RCASBP(A)-EGFP質粒轉染DF-1細胞48 h后的綠色熒光蛋白表達Fig.4 Expression of green fluorescent protein in DF-1 cells after transfection with RCASBP(A)-EGFP plasmid for 48 h

圖5 tva c.3G/G、tva c.3G/A和tva c.3A/A CEF感染RCASBP(A)-EGFP的過程Fig.5 Time course of infection of tva c.3G/G,tva c.3G/A and tva c.3A/A CEFs with RCASBP(A)-EGFP

圖6 流式細胞術檢測tva c.3G>A突變位點不同基因型CEF感染RCASBP(A)-GFP 7 d后的GFP陽性細胞率Fig.6 GFP positive cell rates for CEFs of different genotypes of tva c.3G>A mutation site seven days after infection with RCASBP(A)-GFP detected by flow cytometry

2.3 tva c.3G>A突變致宿主體內抗ALV-A感染

為探究tva c.3G>A突變對宿主體內感染ALVA的影響，利用ALV-A野毒感染tva c.3G>A突變野生型、雜合突變型、純合突變型雛雞。作為陽性對照，9只SPF雛雞攻ALV-A野毒后均為ALVA陽性，說明ALV-A體內攻毒試驗成立。ALVA攻毒試驗結果顯示，野生型tva c.3G/G雛雞(25只)攻ALV-A野毒后均為ALV-A陽性，雜合突變型tva c.3G/A雛雞(28只)攻ALV-A野毒后病毒血癥陽性率為75%，而純合突變型tva c.3A/A雛雞(22只)攻ALV-A野毒后均為ALV-A陰性(表2)。結果表明，tva c.3G>A突變導致宿主體內抗ALVA的感染，ALV-A體內攻毒試驗結果與ALV-A體外感染試驗結果一致，證實tva c.3G>A突變位點為ALV-A的遺傳抗性位點。

表2 ALV-A攻毒后雛雞病毒血癥陽性率Table 2 Positive infection rate of viremia in chicks infected by ALV-A

2.4 tva c.3G>A抗性位點在不同黃羽肉雞品系的基因型頻率分布

不同黃羽肉雞品系tva c.3G>A抗性位點的基因分型結果如表3所示。CB01、CB08、CB10和CB15品系中檢測到tva c.3G>A抗性位點的雜合基因型tva c.3G/A，其頻率分別為0.05、0.05、0.10和0.14，在CB01、CB08、CB10和CB15品系中檢測到純合抗性基因型tva c.3A/A，其頻率分別為0.10、0.15、0.23和0.08，其余黃羽肉雞品系所檢樣品均為野生型tva c.3G/G。

表3 我國黃羽肉雞品系tva c.3G>A抗性位點的基因型頻率分布Table 3 Genotypic frequency of tva c.3G>A resistance locus in Chinese yellow-feathered broiler lines

本研究鑒定了中國黃羽肉雞品系tva受體基因中存在1種自然突變位點，即tva基因編碼區第3位堿基由G突變為A，引起tva基因起始密碼子序列由ATG突變為ATA，致使宿主對ALV-A體外、體內的感染產生遺傳抗性，證實tva c.3G>A突變位點為ALV-A的遺傳抗性位點。據我們所知，本研究首次報道了受體基因起始密碼子序列突變可以引起宿主遺傳性抗特定ALV亞群的感染，這增強了我們對ALV-A宿主共同進化的理解。

盡管種雞群凈化策略和生物安全措施已用來控制禽白血病[20]，但這些傳統方法并不能完全消除禽白血病在中國和東南亞國家的發生與流行[21-22]。ALV在雞群中的流行，致使暴露于ALV的宿主可能會受到選擇性壓力而對ALV的感染產生完全抗性或者至少降低了對ALV感染的易感性。tva、tvb、tvc和chNEH1受體基因分別編碼Tva、Tvb、Tvc和NHE1受體蛋白，分別介導宿主細胞對ALV-A、ALV-B/D/E、ALV-C和ALV-J的感染[14,23-25]。受體基因的遺傳突變會導致受體蛋白的完全缺失或表達一個缺陷型受體蛋白，從而引起宿主對ALV的感染產生遺傳抗性。目前，已在國外某些白來航近交品系和中國肉雞品系中鑒定了致使宿主細胞對ALV-A、ALV-B/D/E和ALV-C感染產生遺傳抗性的受體基因遺傳突變[16,24,26]。Elleder等[16]在白來航品系C中發現tva基因第619堿基由C變為G(tvar1)，引起編碼的氨基酸由Cys改變為Trp，大大降低ALV-A囊膜糖蛋白與Tva受體的親和力，從而對A LV-A的感染產生遺傳抗性。Elleder等[16]在白來航品系72中發現tva基因堿基序列第305—306位點插入CTCG 4個堿基(tvar2)，導致Tva受體蛋白缺失表達，從而產生對ALVA的抗性。Chen等[18]研究發現中國雞種存在tvar3、tvar4、tvar5和tvar6ALV-A遺傳抗性位點，其為位于tva受體基因內含子1破裂點信號保守區域的4種缺失突變，tvar3為tva基因第507—516堿基(序列為ACCCCGCCCC)缺失、tvar4為tva基因第507—511堿基(序列為ACCCC)缺失、tvar5為tva基因第502—511堿基(序列為CGCTCACC CC)缺失、tvar6為tva基因第502—516堿基(序列為CGCTCACCCCGCCCC)缺失，這4種tva受體基因遺傳突變均影響tva基因mRNA的剪切，降低了ALV-A囊膜糖蛋白與Tva受體蛋白結合的親和力，從而降低宿主細胞對ALV-A的易感性。本研究在我國黃羽肉雞品系中發現tva受體基因始密碼子序列由ATG突變為ATA，引起Tva受體蛋白氨基酸序列第1個氨基酸由甲硫氨酸(M)改變為異亮氨酸(I)，推測該突變導致Tva受體蛋白的表達完全缺失，從而引起宿主抗ALV-A的感染。

抗病育種是控制禽白血病的有效策略和重要途徑，為評估不同黃羽肉雞品系對ALV-A的遺傳抗性，本研究對15個黃羽肉雞品系tva c.3G>A抗性位點進行了基因分型，結果發現CB01、CB08、CB10和CB15品系存在tva c.3G>A抗性位點，其純合抗性基因型tva c.3A/A的頻率分別為0.10、0.15、0.23和0.08，提示這些黃羽肉雞品系具有良好的抗ALV-A遺傳改良潛力，可從這些雞品系中篩選出培育抗ALV-A感染的育種素材，并運用于ALV-A遺傳抗性雞品種的選育，為實現A亞群禽白血病抗病育種提供理論依據和技術支撐。