壞死性凋亡基因在腎透明細胞癌中的表達及對預后影響的研究

張磊 姜經航 鄧全紅

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一,也是最常見的腎癌組織病理類型[1-2]。盡管ccRCC局部或根治性腎切除有治愈可能性,但術后仍有部分病例復發或發生轉移,并導致較高的死亡率。目前針對ccRCC的靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療極大改善了患者的治療效果,但也會出現耐藥情況。因此對于ccRCC發生、發展中分子機制的探討以及新的靶基因的預測研究將有助于開發新的治療策略。

壞死性凋亡是一種特殊類型的細胞死亡方式,具有可調控性[3]。壞死性凋亡基因在腫瘤進展、轉移、預后、免疫調節、病理分型和治療中發揮著重要作用,但其與ccRCC預后之間的相關性尚不清楚。本研究從腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數據庫中提取ccRCC轉錄組數據和臨床資料,尋找與ccRCC預后密切相關的壞死性凋亡基因,構建預測預后模型,并使用基因表達綜合(Gene Expression Omnibus, GEO)數據庫中的GSE29609數據進行驗證。

一、研究對象

ccRCC患者RNA轉錄組數據和臨床信息從TCGA數據庫中下載。納入標準:①術后病理診斷為ccRCC;②隨訪時間<30 d的患者。排除標準:①無完整臨床數據;②其他病理類型的腎癌。最終獲得539例ccRCC組織轉錄組數據進行后續分析。

二、數據處理

1.壞死性凋亡基因的獲取:從在線數據庫(https://www.kegg.jp/)中下載壞死性凋亡基因,總共有159個基因納入后續的數據分析。

2.生物信息學分析:以篩選條件(|log2FC|>1,FDR<0.05)為基礎,使用R軟件(4.1.0版本)中limma包(3.13版本)篩選ccRCC和正常組織中的差異表達壞死性凋亡基因。運用基因本體(Gene Ontology, GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes, KEGG)分析差異表達壞死性凋亡基因的功能富集,使用ggplot包對結果進行可視化。然后繼續篩選與ccRCC預后相關的壞死性凋亡基因,采用單因素Cox回歸分析ccRCC總生存期與壞死性凋亡基因之間的關系。將單因素Cox回歸分析篩選出的預后相關壞死性凋亡基因納入多因素Cox回歸分析,確定與ccRCC預后密切相關的壞死性凋亡基因,同時得到預后相關壞死性凋亡基因的回歸系數和危險比。通過在線cBioPortal數據庫(http://cbioportal.org)分析預后相關壞死性凋亡基因的突變情況。

3.構建ccRCC預后模型:以壞死性凋亡基因表達水平和回歸系數的乘積構建預后模型公式。以風險評分中位值為分界線,將ccRCC患者分為高風險組和低風險組,使用Kaplan-Meier法分析兩組的生存率。為了探討風險評分預測ccRCC預后的可靠性及準確性,進一步通過GEO數據庫中的GSE29609數據進行驗證。

一、差異表達壞死性凋亡基因的功能富集

使用GO和KEGG分析壞死性凋亡基因的生物學功能和重要調控網絡,分析結果見圖1。GO分析結果顯示壞死性凋亡基因的生物過程主要涉及病毒反應、外源性凋亡信號通路、調節因子介導的信號通路、壞死性細胞凋亡過程以及對細胞因子刺激響應的調節,在細胞組分上主要與膜微囊、膜微區和炎癥體復合物密切相關,其分子功能上主要涉及細胞因子受體結合、鈣離子依賴、磷酸酯酶A2活性(消耗1,2-二棕櫚酸磷脂酰膽堿)以及磷脂結合等。KEGG分析結果顯示壞死性凋亡基因與細胞壞死性凋亡、甲型流感、MAPK信號通路以及NOD樣受體信號通路等生物學途徑密切相關。

二、差異表達壞死性凋亡基因與ccRCC患者生存和預后的關系

與正常組織比較,ccRCC組織中有29個壞死性凋亡基因高表達、7個壞死性凋亡基因低表達。對36個壞死性凋亡基因進行單因素和多因素Cox分析發現,有7個基因與ccRCC患者的生存和預后密切相關,其中3個基因[FAS配體(FAS ligand, FASLG)、溶質載體家族25A4(solute carrier family 25 member 4, SLC25A4)、信號轉導和轉錄激活因子4(signal transducer and activator of transcription 4, STAT4)]是保護性因素,4個基因[BH3相互作用域死亡激動劑(BH3 interacting domain death agonist, BID)、γ干擾素(interferon gamma, IFNG)、干擾素調節因子9(interferon regulatory factor 9, IRF9)和磷酸酯酶A2IVD(phospholipase A2 group IVD, PLA2G4D)]是危險因素。使用在線cBioPortal數據庫分析這些基因的遺傳突變,發現突變率最高的類型是擴增突變和深度缺失,其中FASLG突變頻率最高(4%)。依據壞死性凋亡基因表達的中位值,將ccRCC患者分為高表達組和低表達組,Kaplan-Meier法分析顯示差異表達壞死性凋亡基因與ccRCC患者的生存密切相關(圖2)。

A:GO分析圖;B:KEGG分析圖圖1 差異表達壞死性凋亡基因GO和KEGG分析

A:BID表達與ccRCC患者預后的關系;B:IFNG表達與ccRCC患者預后的關系;C:IRF9表達與ccRCC患者預后的關系;D:PLA2G4D表達與ccRCC患者預后的關系;E:SLC25A4表達與ccRCC患者預后的關系;F:STAT4表達與ccRCC患者預后的關系圖2 不同壞死性凋亡基因表達ccRCC患者的Kaplan-Meier生存曲線

三、ccRCC患者預后模型公式構建與驗證

多因素Cox分析發現,有7個基因與ccRCC患者的生存和預后密切相關。根據每個差異表達壞死性凋亡基因的回歸系數,構建的預后模型公式:風險評分=0.935×BID表達量-0.647×FASLG表達量+0.816×IFNG表達量+0.499×IRF9表達量+0.587×PLA2G4D表達量-0.328×SLC25A4表達量-0.452×STAT4表達量。根據該公式計算每例ccRCC患者的風險評分,然后以該評分中位值將患者分為高風險組和低風險組。Kaplan-Meier法分析顯示,高風險組患者的生存率比低風險組患者低,差異有統計學意義(P<0.001,圖3)。使用GSE29609數據進行驗證同樣發現,高風險組患者的生存率比低風險組患者低,差異有統計學意義(P=0.047,圖4)。

圖3 ccRCC高風險組和低風險組患者總體生存率曲線

圖4 GSE29609數據驗證ccRCC高風險組和低風險組患者總體生存率曲線

將患者的臨床資料和風險評分結合納入單因素和多因素Cox分析,結果顯示年齡、腫瘤分級和風險評分是影響ccRCC預后的獨立危險因素,而其他臨床指標不具有預測意義(圖5A、B)。同時,以臨床資料和風險評分為基礎構建預測ccRCC患者預后的諾莫圖(圖5C),C指數為0.694,用以預測ccRCC患者1年、3年和5年生存率的受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線下面積(area under cure, AUC)分別為0.735、0.702和0.734(圖5D),提示構建的預后諾莫圖具有較好的預測效能。

A:單因素Cox回歸分析;B:多因素Cox回歸分析;C:ccRCC患者1年、3年和5年總生存率的諾莫圖;D:預測ccRCC患者1年、3年和5年生存率的ROC曲線圖5 ccRCC患者預后危險因素分析和諾莫圖模型的構建與驗證

對于局限性ccRCC,腫瘤切除后復發的風險仍然很高[2]。轉移性ccRCC患者使用特異性分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑可以改善生存預后,如腫瘤細胞產生耐藥則會導致其預后不佳[4]。而對于無法手術切除或轉移性ccRCC患者通常會給予靶向藥物和(或)免疫檢查點抑制劑治療,對于這部分患者應增加臨床隨訪時間和頻率,適時調整,以選擇最佳的輔助治療方式來改善其預后[5]。因此,尋找影響ccRCC患者預后的因素,用以預測其生存率,指導患者進行系統化和個體化治療顯得尤為重要。

有研究指出,壞死性凋亡是由受體結合絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3以及其底物混合譜系激酶結構域樣蛋白共同介導、能夠被Necrostain-1抑制的細胞死亡方式,其與細胞凋亡不同,允許免疫原性細胞內容物釋放,包括損傷相關分子模式和炎癥細胞因子,如白細胞介素-1受體,從而引發炎癥[6]。更深入地了解壞死性凋亡的機制和生理作用將有助于了解這些新的細胞死亡效應因子如何靶向治療炎癥性疾病、或觸發癌細胞死亡和抗癌免疫反應,以及對腫瘤生物學行為的影響,有可能發現腫瘤治療的新靶點[7]。本研究通過分析發現,相對于正常組織,ccRCC組織中有36個壞死性凋亡基因表達具有差異性。功能分析顯示壞死性凋亡基因主要與炎癥體復合物、細胞因子受體結合、壞死性細胞凋亡過程、程序性壞死性細胞死亡、MAPK信號通路以及NOD樣受體信號通路等生物學途徑密切相關。

本研究發現,有7個壞死性凋亡基因與ccRCC患者的生存和預后密切相關,其中3個基因(FASLG、SLC25A4和STAT4)是保護性因素,4個基因(BID、IFNG、IRF9和 PLA2G4D)是危險因素,并且其表達情況與ccRCC患者生存密切相關。在對深靜脈血栓的研究中發現,miR-21在其模型中的表達受到抑制,并通過靶向FASLG調控內皮祖細胞的增殖和血管生成[8]。在腫瘤中,高表達的FASLG可能刺激轉化的細胞對抗Fas表達的腫瘤浸潤淋巴細胞,并導致這些細胞的免疫逃逸[9]。同樣SLC25A4失活會導致乳酸酸中毒、線粒體的過度增殖、氧化磷酸化酶的誘導活性增加、活性氧的增加以及線粒體DNA的過度損傷[10]。STAT4是一種轉錄因子,受IL-12信號的激活,促進Th1細胞分化和IFN-γ的產生[11]。在卵巢癌中,加入Ad-TBID預處理后,癌細胞對順鉑表現出更高的藥物敏感性,線粒體凋亡增加[12]。在胰腺癌患者中使用CDK1/2/5抑制劑可以避免IFNG介導的獲得性腫瘤免疫耐藥,這種免疫化療方法可增強腫瘤細胞的凋亡,刺激CD8+T細胞依賴的抗腫瘤免疫[13]。Kaplan-Meier法分析也顯示,高風險組患者的生存率比低風險組患者低(P<0.001),進一步使用GEO數據驗證也得到相同的結果,證實風險評分與患者的預后密切相關。單因素和多因素Cox分析結果顯示年齡、腫瘤分級和風險評分是影響ccRCC預后的獨立危險因素,而其他臨床指標不具有預測意義。本研究構建的預測ccRCC患者預后的諾模圖,C指數為0.694,用以預測ccRCC患者1年、3年和5年生存率的AUC分別為0.735、0.702和0.734,證實該模型在患者的預后預測中有一定的意義,可用于指導ccRCC患者的個體化治療。

本研究也存在一些局限性。首先,本研究只是從TCGA數據庫中獲得ccRCC預后相關的壞死性凋亡基因,構建預測預后模型公式,通過GEO數據庫中ccRCC患者數據驗證預后模型公式的準確性,并未嚴格區分出人種,所以在應用到我國ccRCC患者中有可能因為人種以及遺傳性等存在一定的差異。其次,本研究樣本量相對較小,尚需要前瞻性和多中心研究來驗證獲得標記基因的預測價值。最后,本研究僅單一使用統計學方法對數據進行分析和處理,后續還需要設計一些實驗來探討所獲得基因與ccRCC患者預后相關的生物學功能以及作用機制。