特基拉芽孢桿菌WRN032對稻瘟病菌的生物防治潛力

蔣建蘭，陳 玉，單瀟瀟，孫 露，喬建軍，張桂山

特基拉芽孢桿菌WRN032對稻瘟病菌的生物防治潛力

蔣建蘭1, 2，陳 玉1, 2，單瀟瀟1, 2，孫 露1, 2，喬建軍1, 2，張桂山3, 4

(1. 天津大學系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；
2. 天津大學化工學院，天津 300072；
3. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；
4. 農業部農業微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081)

植物病原真菌是農作物病害的主要致病菌，導致作物減產，嚴重阻礙農業發展．病原真菌種類繁多，作用機制復雜，防治難度大，傳統化學防治手段無法滿足當今發展需求，而生物防治是一種安全、綠色、高效的防控手段．以來源于土壤和植物根莖的多種細菌為研究對象，以菌種的抑菌活性為指標，采用牛津杯法，篩選出一株具有生物防治潛力的細菌WRN032，對黑腐皮殼菌()、禾谷鐮刀菌()和稻瘟病菌()的生長均具有不同程度的拮抗作用，其中對稻瘟病菌的抑制作用較強．使用石油醚、正丁醇和乙酸乙酯依次對菌株WRN032的發酵液進行萃取，發現其乙酸乙酯提取物對稻瘟病菌有強拮抗作用．結合生理生化鑒定及16S rDNA序列分析對其菌種進行鑒定，結果表明該細菌為特基拉芽孢桿菌()．對特基拉芽孢桿菌WRN032代謝產物中的活性物質進行穩定性試驗，表明其在高溫、強酸性、中性和弱堿性條件下均具有良好的穩定性，且對紫外光不敏感．采用柱層析法和半制備層析法對特基拉芽孢桿菌WRN032發酵液中的活性物質進行分離純化，其純化物對稻瘟病菌的相對抑制率與相同濃度的75%三環唑可濕性粉劑相近．當濃度為100.0μg/mL時，相對抑制率為51.2%，與75%三環唑可濕性粉劑(56.4%)基本相同．研究表明，特基拉芽孢桿菌WRN032具有作為農業生物防治劑的潛力．

特基拉芽孢桿菌；
WRN032；
稻瘟病菌；
分離鑒定；
抑菌活性；
生物防治

由多種致病真菌引起的疾病給全球糧食安全帶來了嚴重威脅[1]．水稻是全球重要的糧食作物[2]，因此人們非常重視水稻的發展和產量的提高[3]．稻瘟病菌()是一種絲狀子囊真菌，是稻瘟病的致病因子，也是水稻長期減產的主要原因[4].目前，常用的稻瘟病防治劑是化學農藥．然而，化學農藥在控制病原真菌的同時也會造成嚴重的環境污染[5-6]．因此，為了保證稻米品質，保護農業生態環境，迫切需要尋找綠色無污染且高效的稻瘟病防治 措施．

微生物是土壤肥力保持和生態系統循環的關鍵物質基礎[7]．利用自然界中發現的微生物對病原體進行生物防治是農業保護的一種有效手段[8-9]．芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，具有豐富的生物資源[10]．近年來，它已被引入植物病害生物防治領域[11]，在防治植物病害、促進植物生長、提高作物產量等方面具有廣闊的應用前景[12]．解淀粉芽孢桿菌()G1可以產生表面蛋白作為殺蚜代謝 物[13]．枯草芽孢桿菌()RC 218是禾谷鐮刀菌的有效拮抗劑，而禾谷鐮刀菌是赤霉病的主要病原體[14]．蘇云金芽孢桿菌()黃粉蟲變種(Xd3)的次生代謝物具有較強的抗衰老活性[15]．由短小芽孢桿菌()產生的茉莉酸、ABA和赤霉素可以明顯促進植物的生長[16-17]．墨西哥的Gatson等[18]首先發現了特基拉芽孢桿菌，其形態和基因組序列與枯草芽孢桿菌相似．目前對特基拉芽孢桿菌的研究主要集中在菌株的分離和鑒定上，尚處于初步階段．從墨西哥谷地的小麥樣品中分離出一株菌株TE3(T)，其16S rRNA序列與芽孢桿菌()相似，DNA雜交結果表明菌株TE3(T)為特基拉芽孢桿菌[19]．隨著人們對特基拉芽孢桿菌的逐漸了解，發現該菌株在生物防治方面也具有很大的研究價值．特基拉芽孢桿菌可產生抑菌物質，如脂肽和生物表面活性劑[20]，以抑制曲霉菌()[21]、土黃色葡萄球菌()和桃褐腐病菌()[22]的生長．然而，關于特基拉芽孢桿菌作為真菌病原體生物防治劑的研究還相對較少，對其活性代謝物也沒有深入的研究．

本文通過篩選試驗，研究了11種細菌的發酵提取物對11種常見作物病原菌的抑菌效果，獲得了具有拮抗作用的活性菌株及其抑菌譜．其中，特基拉芽孢桿菌WRN032對稻瘟病菌表現出強烈的抑制作用．并設計了一系列初步試驗，以評估其作為稻瘟病生物防治劑的潛在價值．

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 菌 株

11種試驗菌株(見表1)來源于多個城市的植物根莖及土壤，主要為一些芽孢桿菌和嗜鹽單胞菌，由中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所分離保存；
11種靶標菌(見表1)為常見的植物病原真菌，由中國農業微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)進行保藏．

1.1.2 儀 器

UV6000 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；
ZWY-211B 臥式恒溫搖床，上海智城有限責任公司；
ME204、ME802 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；
MJB1-B001-Q3滅菌器，無錫益騰壓力容器有限公司；
LRH-70恒溫生化培養箱、DZF-6050 真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；
SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；
N-1100 旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；
3K15 臺式冷凍離心機，SIGMA公司；
Personal thermal PCR儀，BIO-RAD；
DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；
DYCP-31DN電泳槽，北京市六一儀器廠；
Waters e2695-2489高效液相色譜-紫外檢測系統，美國沃特世有限公司．

表1 供試菌株與靶標病原真菌信息

Tab.1 Information of test strains and target pathogenic fungi

1.2 菌株培養條件

試驗菌株均在Landy培養基(MgSO4·7H2O 0.500g/L、KH2PO41.000g/L、KCl 0.200g/L、MnSO4·H2O 0.010g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、CuSO4·5H2O 0.002g/L、酵母提取物 1.000g/L、苯丙氨酸0.020g/L、谷氨酸5.000g/L、(NH4)2SO42.000g/L、檸檬酸鈉 0.010g/L、葡萄糖20g/L)中發酵培養48h[23]，發酵溫度為37℃，轉速為180r/min，初始pH值為6.5；
病原真菌在PDA培養基(馬鈴薯淀粉13%，葡萄糖44%，瓊脂43%)上進行培養，培養溫度為30℃．

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 發酵液預處理

每種試驗菌株活化18h后，于Landy培養基中再培養48h得到發酵液．取不同試驗菌株發酵液各1L，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對發酵液進行萃取，每種有機溶劑均萃取3次，得到相應的石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液．將萃取液分別使用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮，然后在真空干燥箱中進行干燥，最終得到33種干燥提取物．將提取物分別置于棕色瓶中，密封后于4℃遮光保存．

1.3.2 牛津杯法抑菌試驗

采用牛津杯法對33種干燥提取物進行抗病原真菌菌株的篩選．分別將5.0mg干浸膏溶解于0.1mL DMSO(二甲基亞砜)中，并用無菌水稀釋至藥液濃度1.0mg/mL．在PDA培養基上等距離邊緣放置3個直徑均為6mm的牛津杯，在培養基正中間接種病原真菌．每組試驗重復3次．其中試驗組：向牛津杯中滴加100μL 1mg/mL藥液；
空白對照：滴加等體積DMSO溶液(DMSO與無菌水體積比為1∶49)；
陰性對照：滴加等體積無菌水．將培養基在30℃下培養7～14d，測量試驗菌株對每種病原真菌的抑菌圈直徑，以篩選具有抗菌活性的拮抗菌株．

1.4 拮抗菌株的鑒定

1.4.1 生理生化鑒定

參考東秀珠等[24]的方法，對菌株WRN032進行革蘭氏染色試驗、明膠液化試驗、碳源利用試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、吲哚試驗、耐鹽性試驗共9項生理生化特征分析試驗．每組試驗重復處理3次，觀察現象．

1.4.2 分子生物學鑒定

利用商業試劑盒(TaKaRa MiniBEST Bacteria genomic DNA extraction 68試劑盒3.0版)提取基因組DNA．試驗菌株16S rRNA基因組擴增的引物為通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′．以拮抗菌株WRN032的基因組為模板進行PCR擴增，擴增產物經回收后送至北京擎科生物科技有限公司(中國北京)進行測序．將序列結果在NCBI網站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行BLAST比對，篩選近源物種的序列，并利用MEGA 6.0軟件繪制系統發育樹，根據親緣關系確定菌株WRN032的種屬．

1.5 菌株WRN032提取物的抑菌效果穩定性測試

1.5.1 酸堿穩定性

將發酵提取物溶解于二甲基亞砜中，制備濃度為50.0mg/mL，pH值分別為1、3、5、7、9、11、13的7種樣品溶液，4℃保持24h后，將每種樣品溶液0.5mL與PDA培養基(1∶49，體積比)混合，以制備終濃度為1.0mg/mL的混合物藥液．將混合物倒入一次性培養皿中，并在培養皿中心接種稻瘟病菌．以不含提取物的DMSO溶液作為對照，每組試驗重復3次．30℃恒溫培養7d后，測量稻瘟病菌菌落直徑，按照式(1)計算相對抑制率．

式中：1為對照組菌落直徑；
2為試驗組菌落直徑．

1.5.2 熱穩定性

制備終濃度為1.0mg/mL的混合物藥液，分別在25℃、40℃、60℃、80℃、100℃和121℃下處理30min．冷卻至室溫后進行熱穩定性試驗并計算相對抑制率．具體試驗步驟與第1.5.1節相同．

1.5.3 紫外線穩定性

制備終濃度為1.0mg/mL的混合物藥液，分別在紫外光(24W)照射下處理1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h后，進行紫外線穩定性試驗并計算相對抑制率．具體試驗步驟與第1.5.1節相同．

1.6 活性物質的純化

采用活性追蹤法從發酵液中分離活性物質．用乙酸乙酯提取菌株WRN032的無菌培養濾液，得到粗提物．粗提物通過硅膠(zcx-Ⅱ)柱層析分離，并分別使用比例為99∶1、99∶5、99∶10、99∶99、0∶99(體積比)的CH2Cl2/MeOH進行梯度洗脫，得到5個組分(Fr.1～Fr.5)．測量并比較5種組分對稻瘟病菌的抑菌活性．活性最高的Fr.5部分通過半制備液相色譜分離，流動相為CH3CN/H2O(3∶7，體積比)，收集分離出的化合物1、2和3．采用牛津杯法篩選3種化合物中對稻瘟病菌抑制作用最強的組分，以供進一步研究．

1.7 活性物質抑菌效果的評估

三環唑是農業上常用的抑制稻瘟病菌生長的抗真菌藥物．因此選擇75%三環唑可濕性粉劑為陽性對照，對純化后的活性物質進行抑菌效果的評估．將抑菌效果最強的化合物2以DMSO溶解后與PDA培養基混合，制備藥液終濃度分別為100.0μg/mL、50.0μg/mL、25.0μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL和3.125μg/mL的混合物培養基．將混合物培養基倒入培養皿中，并在培養皿中心接種稻瘟病菌．以75%三環唑可濕性粉劑為對照組，其處理方法與化合物2相同．每組試驗重復3次．30℃恒溫培養7d后，測量稻瘟病菌菌落直徑，計算相對抑制率．

2.1 拮抗菌株篩選結果

經過363組篩選試驗，篩選出5種具有抑菌活性的發酵液提取物．活性發酵液提取物的抑菌圈直徑如表2所示．與孫露等[25]合作試驗得到，樣品藥液濃度均為1.0mg/mL時，菌株WRN032發酵液的乙酸乙酯萃取物對黑腐皮殼菌、禾谷鐮刀菌和稻瘟病菌的抑菌圈直徑分別為9.82mm、10.40mm和22.31mm，表明菌株WRN032的發酵產物對稻瘟病菌具有較強的拮抗作用．稻瘟病是水稻四大病害之一，對水稻產量影響很大．稻瘟病菌是稻瘟病的主要病原菌．因此，可以進一步對菌株WRN032發酵產物進行研究，以評估其作為稻瘟病生物防治劑的潛力．

表2 活性菌株發酵液萃取物的抑菌圈直徑

Tab.2 Inhibitory zone diameter of the fermentation broth extract of the active strain

注：表中數據為3次平行試驗抑菌圈直徑的平均值，括號內數據為對應的3個誤差值；
“—”表示牛津杯周圍無抑菌圈．

2.2 菌株WRN032的生物學特性

2.2.1 生理生化特性

將菌株WRN032染色后進行鏡檢，細胞呈現紫色，表明該菌株為革蘭氏陽性菌．菌株WRN032的生理生化試驗結果見表3，顯示其能使淀粉水解及明膠液化，同時具有一定程度的耐鹽性．

2.2.2 分子生物學鑒定結果

菌株WRN032是從香菇廢蘑菇堆肥中分離得到的．根據NCBI上BLAST的16S rDNA比較，菌株WRN032與特基拉芽孢桿菌Y16的相似性約為99.93%．菌株WRN032的系統發育樹如圖1所示.根據16S rDNA測序和系統發育分析，菌株WRN032被鑒定為特基拉芽孢桿菌．

表3 菌株WRN032生理生化試驗結果

Tab.3 Physiological and biochemical test results for strain WRN032

注：“＋”表示陽性；
“－”表示陰性．

2.3 菌株WRN032代謝產物抑菌效果的穩定性

pH值在1～7范圍內，特基拉芽孢桿菌WRN032代謝物對稻瘟病菌的抑制效果隨pH值增加而增加；
但隨著堿濃度的增加，抑菌效果明顯降低(圖2(a))．代謝產物的抑菌活性在25～100℃的溫度下保持穩定，100℃下處理30min，抑菌率仍能達到41.7%．但當溫度為121℃時，抑菌率顯著降低(圖2(b))．代謝產物在紫外線處理0～10h內都有顯著抑菌作用，處理10h時抑菌率仍能達到50%左右(圖2(c))．

圖1 菌株WRN032的系統發育樹

圖2 pH、溫度和紫外線處理對特基拉芽孢桿菌WRN032發酵液提取物抗真菌活性的影響

2.4 活性物質的分離

發酵液成分復雜，需要對其進行分離純化，以獲得更好的應用所需的活性物質．通過柱層析洗脫，得到5個組分．餾分5用100%甲醇洗脫，具有很強的抑制作用，并被選擇用于進一步純化．如圖3所示，通過半制備液相色譜法從餾分5中收集了3種物質．化合物1、化合物2和化合物3的保留時間分別為18.8～21.5min、23.2～25.7min、28.8～32.3min．3種化合物抗真菌效果的比較如圖4所示．化合物2表現出較強的活性，保留時間為23.2～25.7min．因此，選擇化合物2作為最有效的物質，以進一步評估其對稻瘟病菌的抗真菌活性．

圖3 餾分5的半制備色譜圖

圖4 通過半制備色譜分離的3種化合物對稻瘟病菌的抑菌作用

2.5 活性物質的抑菌作用評估

純化后的活性物質對稻瘟病菌的生長有明顯的抑制作用．由圖5可知，隨著濃度的增加，活性物質的抑菌效果不斷增強．在相同濃度下，化合物2和75%三環唑可濕性粉劑對于稻瘟病菌具有相似的抑菌活性．當濃度為100.0μg/mL時，化合物2的抑菌率為51.2%，與75%三環唑可濕性粉劑(56.4%)基本相同．由此可知，純化后的物質對稻瘟病菌有較強的拮抗作用．因此，特基拉芽孢桿菌WRN032對稻瘟病菌有著較高的生防潛力．

圖5 純化后的活性物質和75%三環唑可濕性粉劑在不同濃度下的相對抑制率

農作物尤其是水稻，是與人類生存緊密相關的植物．稻瘟病菌、灰霉病菌等植物病原真菌給農業經濟帶來嚴重損失．因此，開發生物防治方法來控制病原真菌是一種有效手段．

本研究通過大量篩選試驗，獲得了一種具有生物防治潛力的細菌WRN032及其抗真菌譜，為其生物防治研究提供了理論依據．菌株WRN032對黑腐皮殼菌、禾谷鐮刀菌和稻瘟病菌的生長均具有不同程度的拮抗作用，其中對稻瘟病菌的抑制作用較強．通過生理生化試驗及16S rDNA序列分析，該菌株被鑒定為特基拉芽孢桿菌．穩定性試驗結果表明，菌株WRN032的代謝產物在高溫、強酸、中性、弱堿及紫外光照射條件下均能保持較高的活性，意味著其應用范圍廣，不易因環境影響而失去活性，可以為開發高效穩定的稻瘟病生物防治劑提供了研究基礎．通過一系列分離操作，從菌株WRN032的發酵液中獲得了高活性的純物質，其對稻瘟病菌的抑制效果與相同濃度的75%三環唑可濕性粉劑相似．當濃度為100.0μg/mL時，該純化產物對稻瘟病菌的相對抑制率為51.2%，與同濃度的75%三環唑可濕性粉劑(56.4%)基本相同．綜上所述，特基拉芽孢桿菌WRN032對稻瘟病菌有較強的抑制作用，有望成為稻瘟病菌的生物防治劑．

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Biological Control Potential ofWRN032 Against

Jiang Jianlan1, 2，Chen Yu1, 2，Shan Xiaoxiao1, 2，Sun Lu1, 2，Qiao Jianjun1, 2，Zhang Guishan3, 4

(1. Key Laboratory of Systems Bioengineering(Ministry of Education)，Tianjin University，Tianjin 300072，China；
2. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；
3. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；
4. Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China)

Plant pathogenic fungi are the main pathogens of crops that reduce crop yield and hinder agricultural development. Many kinds of pathogenic fungi have been identified with complex mechanisms of action leading to prevention and control difficulties. Traditional chemical control methods do not meet the needs of agriculture today，but biological control is a safe，green，and efficient means of prevention and control. We selected a variety of bacteria from soil and plant rhizomes as research objects and used the antibacterial activity of the bacteria as an index. The bacterial strain WRN032 with biological control potential was screened using the Oxford cup method. WRN032 has antagonistic effects on the growth of，，and，among which the inhibitory effect onwas strong. The fermentation broth of strain WRN032 was extracted with petroleum ether，n-butanol，and ethyl acetate，in turn. The ethyl acetate extract of strain WRN032 had strong activity against. The strain was identified using physiological and biochemical methods and 16S rDNA sequence analysis. The results showed that the bacterium was. A stability test of the active substance in the metabolites ofWRN032 revealed good stability under high temperature，strong acid，neutral，and weak alkali conditions and was not sensitive to ultraviolet light. The active substance in theWRN032 fermentation broth was isolated and purified by column chromatography and semi-preparative chromatography. The relative inhibition rate of the purified products against rice blast was similar to that of 75% tricyclazole wettable powder at the same concentration. When the concentration was 100.0μg/mL，the relative inhibition rate was 51.2%，which was similar to the 75% for tricyclazole wettable powder(56.4%). This study shows thatWRN032 has potential as an agricultural biological control agent.

；
WRN032；
；
isolation and identification；
antibacterial activity；
biological control

10.11784/tdxbz202205014

Q939.9

A

0493-2137(2023)09-0935-07

2022-05-10；

2022-09-19.

蔣建蘭（1972— ），女，博士，研究員，jljiang@tju.edu.cn.Email：m_bigm@tju.edu.cn

張桂山，zhangguishan@caas.cn.

國家自然科學基金資助項目(31670113)；
國家重點研發計劃資助項目(2017YFD0201401).

the National Natural Science Foundation of China(No. 31670113)，the National Key Research and Development Program of China(No. 2017YFD0201401).

(責任編輯：田 軍)