Box-Behnken響應面法優化紫羅蘭酮β-環糊精包合物的制備工藝

張 楠，李青卓，梅興國，吳 詩*

(1.湖北科技學院醫學部藥學院，湖北 咸寧 437100；
2.咸寧市藥物產業技術研究院)

桂花別名木犀，屬木樨科常綠灌木或喬木，具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗腫瘤、神經保護、抗衰老等藥理活性[1-2]。從金桂提取出的有效成分中11.6%是紫羅蘭酮，其具有抑制癌細胞增殖、轉移和誘導癌細胞凋亡等良好抗癌活性[3-5]，但它的化學性質不穩定，水溶性差，易揮發及生物利用度低，限制了在臨床上的應用。因此，需要采用一種新型制劑來減少紫羅蘭酮的揮發，提高它的臨床使用效率。

β-環糊精(β-CD)是美國食藥局認可的食品添加劑，具有親水外表面和疏水中心腔的環狀碳水化合物，可以與多種無機、有機小分子結合成主客體分子囊[6-7]，又因它無臭、無毒、分子孔徑大小合適、成本低，被普遍運用于環保、農藥、食品、化妝品、醫藥等領域[8]。β-環糊精可以增加藥物的穩定性，提高難溶藥物的水溶性，所以它常被用作揮發油類藥物的常用輔料[9-10]。

本研究將以β-環糊精為材料包合紫羅蘭酮，使紫羅蘭酮可以盡可能減少揮發，發揮最大藥效。以包合率為指標，并使用Box-Behnken響應面法優化紫羅蘭酮/β-環糊精包合物的制備工藝，以期改善紫羅蘭酮的水溶性和提高其穩定性，為紫羅蘭酮的廣泛應用提供依據。

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);HJ-A4恒溫磁力攪拌水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司);ME1002電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);SHB-95B循環水式多用真空泵(上海振捷實驗設備有限公司)；
DZ-2BCIV真空干燥箱(天津市斯泰特儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

紫羅蘭酮(實驗室自提，92.0%);β-環糊精(孟州市華興生物化工有限公司);無水乙醇(天津賽孚瑞科技有限公司)；
二甲基亞砜(天津百倫斯生物科技有限公司)。以上試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫羅蘭酮β-環糊精包合物的制備

采用飽和水溶液法制備紫羅蘭酮β-環糊精包合物。稱取紫羅蘭酮溶于少量無水乙醇中，β-環糊精在一定溫度下溶于純水制成飽和溶液，并在同等溫度下將紫羅蘭酮乙醇溶液緩慢滴入，持續攪拌至包合完全。反應完全后冷卻至室溫，用無水乙醇抽濾，放入真空干燥箱中40℃干燥4h，即得紫羅蘭酮β-環糊精包合物。

1.3.2 紫外分光光度法測定包合物含量

(1)溶液的配制。對照品溶液的配制:取紫羅蘭酮對照品25mg于100mL容量瓶中，加二甲基亞砜定容至刻度線，配制成0.25mg/mL的溶液。

供試品溶液的配制:取包合物50mg于25mL的容量瓶中，加二甲基亞砜稀釋，搖勻使其完全溶解后定容至刻度。

(2)標準曲線的制備。取紫羅蘭酮25mg，置于100mL容量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，作為儲備液；
精密稱取儲備液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL置于10mL容量瓶中，加二甲基亞砜定容，搖勻，在291nm處測定吸光度，以吸光度(A)對紫羅蘭酮的濃度(μg/mL)進行回歸曲線。

(3)含量測定。取(1)項下供試品溶液，由文獻[4]中得出紫羅蘭酮在291nm處為它的特征峰，故在291nm處測定吸光度，帶入標準曲線，計算紫羅蘭酮平均濃度，紫羅蘭酮包合物收得率和包合率公式如下：

1.3.3 單因素實驗

在預實驗的基礎上，分別對紫羅蘭酮/β-環糊精包合物的制備過程中影響紫羅蘭酮含量和包合率的3個主要因素(包合溫度、包合時間、紫羅蘭酮與β-環糊精投料比)進行考察。

(1)包合溫度的影響。稱取β-環糊精2g，紫羅蘭酮1g，共5份，按“1.3.1”方法制備紫羅蘭酮/β-環糊精包合物，其中β-環糊精飽和溶液的溶劑為蒸餾水，β-環糊精與紫羅蘭酮的投料比為2∶1，包合時間為4h，包合溫度分別為40.0、50.0、60.0、70.0、80.0℃。再按“1.3.2(3)”項下方法測定紫羅蘭酮含量。

(2)包合時間的影響。稱取β-環糊精2g，紫羅蘭酮1g，共5份，按“1.3.1”方法制備紫羅蘭酮β-環糊精包合物，其中β-環糊精飽和溶液的溶劑為蒸餾水，β-環糊精與紫羅蘭酮的投料比為2∶1，包合溫度為60℃，包合時間分別為2、3、4、5、6h。再按“1.3.2(3)”方法測定紫羅蘭酮含量。

(3)β-環糊精與紫羅蘭酮投料比的影響。稱取β-環糊精和紫羅蘭酮，共5份，按“1.3.1”方法制備紫羅蘭酮β-環糊精包合物，其中β-環糊精飽和溶液的溶劑為蒸餾水，包合時間為4h，包合溫度為60℃，β-環糊精和紫羅蘭酮的投料比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。再按“1.3.2(3)”方法測定紫羅蘭酮含量。

1.4 Box-Behnken響應面法優化試驗

參考文獻[11]及預試驗結果，確定制備β-環糊精飽和溶液的溶劑為純化水，以紫羅蘭酮包合率為指標，包合溫度(A/℃)、包合時間(B/t)、β-環糊精和紫羅蘭酮的投料比(C)為因素，設置-1、0、1的3個不同水平進行試驗，因素與水平見表1。

表1 因素與水平

2.1 標準曲線的制備

在291nm處測定吸光度，以吸光度(A)對紫羅蘭酮的濃度(μg/mL)進行回歸曲線?；貧w方程為A=0.0073c+0.0094，R2=0.999。結果表明在20～120μg/mL范圍內紫羅蘭酮的濃度與吸光度線性關系良好，見圖1。

圖1 紫羅蘭酮對照品標準曲線圖

2.2 單因素實驗設計

2.2.1 包合溫度的影響

在40℃～80℃時，紫羅蘭酮含量隨溫度的升高而升高，當溫度升高至60℃，包合率達到最大，紫羅蘭酮的含量達到最大，當溫度繼續升高時，紫羅蘭酮含量降低。分析原因可能是溫度升高，具有揮發性紫羅蘭酮分子被揮發，且隨著分子熱運動，不利于氫鍵的形成。

2.2.2 包合時間的影響

在制備4h時，包合率達到最大，紫羅蘭酮含量達到最大，包合時間加長后紫羅蘭酮含量降低。

2.2.3 β-環糊精與紫羅蘭酮投料比的影響

β-環糊精與紫羅蘭酮的投料比為1∶1～3∶1時，雖然包合物收得率越來越高，但是紫羅蘭酮包合率投料比為2∶1時達到最佳，見表2。

表2 不同投料比對包合效果的影響(%)

2.3 響應面實驗設計

2.3.1 響應面實驗設計結果

將表1數據輸入Design-Expert 10軟件，生成17組試驗方案，見表3。

表3 Box-Behnken設計與結果

2.3.2模型的建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對表3的數據進行分析，方差分析結果見表4。

表4 方差分析結果

模型的F=170.83、P<0.0001，表明回歸方程擬合度良好，失擬項P=0.836>0.05，失擬項不顯著，表明實驗設計可靠，均能用模型描述，可以用于紫羅蘭酮/β-環糊精包合物的處方優化。以紫羅蘭酮包合率為響應值時，影響的顯著性排序:投料比(C，P<0.0001)>包合溫度(A，P<0.01)>包合時間(B，P>0.01);二次項A2、B2、C2均P<0.0001，表明交互項均都顯著影響。決定系數達到0.9955，校正擬合度值和預測擬合度值分別為0.9896和0.9419，兩值相近且其差值<0.2，說明該回歸方程具有很好的可信度。

根據試驗結果，以紫羅蘭酮包合率(Y)為響應值對包合溫度(A)、包合時間(B)、β-環糊精與紫羅蘭酮的投料比(C)進行多元線性回歸和二次多項式方程擬合，得回歸方程:Y=42.60+1.25A-0.37B+5.88C+2.75AB-0.25AC-1.00BC-4.80A2-9.55B2-8.55C2。見表5。

表5 二階多項式回歸系數

紫羅蘭酮包合率的實際值和預測值見圖2，實際值與預測值基本接近，說明模型建立成功。為了進一步使這個模型更加完整，我們進行了殘差分析，通過分析殘差與預測，正態概率和響應完成?；旧纤械狞c都落一條直線上，說明數據均是正常分布的。

圖2 殘差分析圖

2.3.3 響應面分析

以包合溫度(A)、包合時間(B)、β-環糊精和紫羅蘭酮的投料比(C)為自變量，紫羅蘭酮包合率為因變量，固定包合溫度，改變包合時間和投料比，以此類推。應用Design-Expert 10軟件分析包合時間和投料比與包合溫度對應的關系。三個因素對紫羅蘭酮包合率的等高線圖和響應面圖見圖3。

由圖3可知，紫羅蘭酮包合率受到各因素相互作用的影響，交互效應的大小可通過等高線的形狀反映出來。兩因素的交互作用較強，則等高線呈橢圓形，反之則呈圓形。交互作用的強弱也可通過響應曲線的斜率判斷，越陡說明交互作用越強。由三幅等高線圖可以看出，時間和投料比的圖為圓形，表示交互作用不顯著，時間與溫度、時間與投料比各因素的相互作用的等高線呈現明顯的橢圓形，說明各因素之間交互作用顯著。從響應面3D圖可以看出，對紫羅蘭酮影響最大的是紫羅蘭酮和β-環糊精的投料比和包合溫度，其次是包合時間，數據結果也證明上述結論，3個因素相對應的P均<0.05，達到了顯著水平。

圖3 響應面及等高線圖

通過Design-Expert.V 10軟件對模型求解方程，得到最優工藝條件:稱取紫羅蘭酮溶于少量無水乙醇中，兩倍量紫羅蘭酮的β-環糊精溶于純水中在60℃下制成飽和溶液，并在同等溫度下將紫羅蘭酮乙醇溶液緩慢滴加入β-環糊精中，持續攪拌4h至包合完全。反應后冷卻至室溫，用無水乙醇抽濾，放入40℃真空干燥箱中干燥4h，即得紫羅蘭酮/β-環糊精包合物。本實驗驗證在該條件下紫羅蘭酮/β-環糊精包合物的紫羅蘭酮包合率達到最大值42.0%。該工藝條件穩定、可靠，同時也說明建立的回歸模型合理。

本文研究β-環糊精對紫羅蘭酮的包合，通過物理吸附，使紫羅蘭酮與β-環糊精內壁產生分子間氫鍵，繼而完成包合。再結合Box-Behnken響應面法，可以給出最直觀的圖像解析，通過數據快速給出最優值。并且設計點少，運行成本低，此方法避免了紫羅蘭酮的揮發性，與β-環糊精的結合也極大提高了紫羅蘭酮的水溶性和生物利用度。上述實驗證明，包合時間、包合溫度可最大化程度使紫羅蘭酮分子活躍，進入載體空穴[12]的影響都很顯著。該方法簡潔、快速、準確，可為紫羅蘭酮實際廣泛應用提供參考意義。