唾液乳桿菌引起的胃惡性腫瘤肝轉移患者菌血癥1例

倪麗君，郭建

上海市東方醫院南院檢驗科，上海 200123

乳桿菌屬(Lactobacillus)為革蘭氏陽性無芽胞桿菌，一般呈鏈桿狀或球桿狀，因能發酵糖類產生大量乳酸而得名。乳桿菌屬細菌在自然界中分布廣泛，有些是人和動物口腔、腸道及陰道的正常菌群[1-2]。此屬細菌中大多數是益生菌，極少數可引起急性膽囊炎、心內膜炎和菌血癥等，尤其是對于免疫功能低下的人群[3-5]。其中鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)是最常見的致病菌，而唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)引起的感染很少見，尤其是血流感染[3-4]。2018年11月，本研究團隊從上海市東方醫院南院胃腸外科收治的1例胃惡性腫瘤肝轉移患者的血液樣本中分離出1株唾液乳桿菌，現報道如下。

1.1 病例資料

患者，男，34歲，因發現胃潰瘍4年、癥狀加重1個月，于2018年8月24日入院。入院后完善相關檢查，診斷胃惡性腫瘤，病理報告提示部分印戒細胞癌，上腹計算機斷層掃描(computed tomography，CT)提示肝轉移?；颊甙l病以來胃納可，睡眠可，兩便正常，體重無明顯減輕。腎結石病史4年，未行治療，否認糖尿病、高血壓、冠心病病史，否認結核病、乙型肝炎等傳染疾病史。否認輸血史，否認其他藥物、食物過敏史。輔助檢查結果提示，無化療絕對禁忌證。與患者家屬充分溝通后，先行化療。具體化療方案為FLOT方案：奧沙利鉑150 mg靜脈滴注d1+亞葉酸鈣0.4 g靜脈滴注d1+多西他賽80 mg靜脈滴注d1+氟尿嘧啶4.4 g靜脈滴注d1?；熐坝璧厝姿煽惯^敏，托烷司瓊止吐，同時輔以護胃、保肝及支持治療；
化療過程中無毒副反應。

2018年11月5日，患者在全身麻醉下行根治性遠端胃大部切除術(畢Ⅰ式吻合)+肝左外葉切除術+腸粘連松解術。術中置腹腔引流管1根，無感染相關癥狀及體征?；颊哂?1月17日突發畏寒、寒戰，查體溫39.0 ℃，白細胞(white blood cell，WBC)11.83×109/L，中性粒細胞(neutrophil，N)84.5%，C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)71.1 mg/L，降鈣素原(procalcitonin，PCT) 0.79 ng/mL，白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)222.6 pg/mL。予以拔除經外周插管的中心靜脈導管(peripherally inserted central catheter，PICC)，送雙側雙瓶血培養。臨床予以異丙嗪鎮靜，地塞米松退熱，頭孢哌酮舒巴坦抗感染治療。

血培養雙側需氧瓶及右側厭氧瓶均于培養2～3 d內檢出唾液乳桿菌，結合相關檢查，診斷為術后血流感染。藥敏試驗提示對青霉素、美洛培南、氨芐西林等敏感，調整用藥后使用美洛培南進行抗感染治療。治療后復查血培養結果均為陰性。11月27日血常規結果提示：WBC為6.64×109/L，N為54%，CRP為18.05 mg/L，PCT為0.107 ng/mL，感染得到有效控制。

1.2 血培養與細菌鑒定

11月17日，于患者左右兩側肘正中靜脈無菌采集靜脈血，分別將8～10 mL靜脈血注入需氧血培養瓶和厭氧血培養瓶(美國賽默飛世爾科技公司)，使用VersaTREK全自動微生物培養檢測系統(美國賽默飛世爾科技公司)培養。培養48～72 h后，VersaTREK全自動微生物培養檢測系統報雙側需氧瓶和右側厭氧瓶陽性。在生物安全柜內，用無菌注射器穿刺取需氧瓶血培養液，分別轉種于血平板、巧克力平板和麥康凱平板，置于35 ℃、體積分數5%的 CO2環境中培養。厭氧瓶血培養液轉種后置于厭氧袋內，于35 ℃厭氧環境中培養，并于35 ℃需氧環境中做耐氧試驗。抽取血培養瓶內培養液直接涂片進行革蘭氏染色鏡檢。

將轉種的平板分別置于體積分數5% CO2環境和厭氧環境進行培養，24～48 h后觀察菌落形態；
并涂片染色鏡檢。

1.2.1 VITEK 2 Compact全自動細菌分析儀將純培養菌落用0.45% NaCl溶液配制菌懸液，調整菌懸液濃度至2.7～3.3麥氏單位，使用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動細菌分析儀及其配套的厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡(anaerobic and corynebacteria identification card，ANC)進行細菌鑒定。

1.2.2 安圖生物Autof ms 1000全自動微生物質譜儀采用直接涂抹法和標準處理法，于安圖生物Autof ms 1000全自動微生物質譜檢測系統中進行細菌鑒定。直接涂抹法為取少量純培養菌落直接涂抹于96孔金屬靶板，并滴加1 μL 70%甲酸待干，再滴加1 μL基質液，干燥后上機采集圖譜進行鑒定分析。標準處理法為取少量純培養菌落置于1.5 ml離心管中，加入700 μL乙醇溶液，漩渦振蕩形成懸浮液，13 000 r/min離心5 min后棄上清液，將離心管在室溫下干燥，再加入30 μL 70%甲酸和30 μL乙腈溶液并混勻，13 000 r/min離心5 min后，取1 μL上清液滴加在96孔金屬靶板上，待干，再滴加1 μL基質液，干燥后上機采集圖譜進行鑒定分析。

1.2.3 16S rRNA測序取生長良好的純菌落，按基因組提取試劑盒操作步驟提取基因組。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增16S rRNA的反應體系為：脫氧核苷酸5 μL，引物Primer F 1 μL，引物Primer R 1 μL，DNA模板提取液5 μL，2×PCR MIX 25 μL。16S rRNA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
16S rRNA-R：GGTTACCTTGTTACGACTT，擴增片段 1 500 bp。凝膠電泳結果提示，1 500 bp處出現條帶，將擴增產物送上海賽音生物技術有限公司進行測序，測序結果上傳至美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)GenBank數據庫進行BLAST比對。

1.3 藥敏試驗

從平板挑取純菌落制備成0.5麥氏濁度標準的菌懸液，按湖南長沙天地人生物科技有限公司的厭氧菌藥敏試驗卡(TDR ANA-AST)說明書進行藥敏試驗，參考美國臨床和實驗室標準協會的CLSI M45-A3藥敏標準中乳桿菌屬藥敏試驗規定，將藥敏板置于35 ℃、體積分數5% CO2環境中培養24～48 h，分別判讀結果。

2.1 血培養與細菌鑒定

將報陽性結果的血培養液用無菌注射器穿刺抽取，直接涂片進行革蘭氏染色，顯微鏡下查見革蘭氏陽性桿菌，呈棒狀球桿菌，具有圓形頂端，可形成鏈狀(見圖1)。將血培養液分別轉種于血平板、 麥康凱平板及巧克力平板，置于35 ℃、體積分數5%CO2環境和厭氧環境培養24～48 h，形成直徑約為0.5 mm的小菌落，菌落呈圓形、不透明，表面凸起、粗糙(見圖2)。經涂片革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性桿菌，與血培養液直接涂片染色鏡檢結果一致。觸酶試驗結果為陰性。

圖1 唾液乳桿菌革蘭氏染色鏡下結果

圖2 唾液乳桿菌于血平板培養48 h后的菌落形態

VITEK 2 Compact鑒定結果為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)，一致性為99%。Autof ms 1000質譜儀直接涂抹法和標準處理法的鑒定結果均為唾液乳桿菌，分值分別為9.506和9.68。將16S rRNA測序結果在GenBank數據庫(http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行BLAST比對分析，鑒定結果為唾液乳桿菌，一致性為99%，與質譜鑒定結果一致。

2.2 藥敏試驗

使用TDR ANA-AST藥敏試驗卡進行藥敏試驗，置于35 ℃、CO2體積分數5%的環境中，培養24～48 h后判讀結果。藥敏結果為：青霉素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為0.25 μg/mL，美洛培南為0.25 μg/mL，氨芐西林為0.25 μg/mL，克林霉素為0.25 μg/mL，利奈唑胺為1 μg/mL，頭孢曲松為1 μg/mL，頭孢哌酮為 1 μg/mL，紅霉素為0.25 μg/mL，左旋氧氟沙星為 2 μg/mL，達托霉素為0.5 μg/mL。參考CLSI M45中乳桿菌屬藥敏試驗結果進行判讀：唾液乳桿菌對青霉素、美洛培南、氨芐西林、克林霉素、利奈唑胺、紅霉素和達托霉素敏感，而頭孢曲松、頭孢哌酮、左氧氟沙星則無判讀標準(見表1)。

圖3 唾液乳桿菌16S rRNA測序比對結果

乳桿菌屬細菌通常定植于上口腔、呼吸道、腸道和陰道，是人體內主要正常菌群。通常被認為是非致病性的，并且無毒，但偶有報道可引起嚴重感染，包括心內膜炎、肺部感染、腹腔內膿腫、腦膜炎、結膜炎、 齲齒和子宮內膜炎[4]。唾液乳桿菌是一種兼性厭氧菌，有時在微需氧條件下也可生長。惡性腫瘤、白血病、糖尿病、長期使用免疫抑制劑、手術創傷、組織破壞均易誘發厭氧菌感染。厭氧菌感染所導致的血流感染占比高達10%～15%，新生兒中厭氧菌血流感染較為常見[6]。在外科手術患者中，術后厭氧菌引發的感染是導致患者術后死亡的重要原因。

表1 唾液乳桿菌的微量肉湯法藥敏試驗結果

查閱國內外文獻，發現僅有2例報道在血培養標本中分離出唾液乳桿菌[3-4]。唾液乳桿菌作為定植于人體的正常菌群，通過血流播散引起感染較為少見。本例唾液乳桿菌引起的血流感染可能與患者惡性腫瘤化療后免疫力低下且又經歷外科手術有關，往往是內源性感染。

乳桿菌屬的生長培養特性使其在生長不充分或生化反應較弱甚至不反應時，傳統的細菌生化鑒定結果很難被判讀，導致難以得到準確的鑒定結果，這為臨床精準治療帶來了很多阻礙?；|輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一種新型微生物快速鑒定方法，可依據特征性蛋白圖譜對標本進行分類和鑒定，在微生物領域得到了廣泛應用[7-9]。由于質譜鑒定的是細菌表面蛋白，而蛋白主要取決于細菌自身遺傳因素，受培養基、培養時間及培養條件等外部因素的影響較小，因而質譜鑒定具有較好的穩定性和可重復性。16S rRNA測序鑒定細菌雖然可得到準確結果，但實驗過程較為繁瑣，且耗時較長。相比之下，MALDI-TOF MS在快速鑒定方面更有優勢。但對于臨床較為少見的致病菌，在使用質譜進行快速鑒定后，應再使用16S rRNA測序進行確認，以彌補質譜菌株庫不足導致的鑒定誤差。

對于從血培養標本和其他無菌部位標本分離得到的致病菌，臨床實驗室應常規開展藥敏試驗，根據細菌培養鑒定結果以及規范的藥敏試驗結果選擇抗菌藥物進行治療。但厭氧菌的培養和藥敏試驗需要特定的條件和時間，在不能及時獲得藥敏結果的情況下，臨床醫師可進行經驗性用藥，待藥敏試驗結果發布后再根據需要對治療方案進行調整。按照規范進行微生物標本送檢是快速分離致病菌的前提，準確快速地進行菌種鑒定是經驗用藥的基礎[10]。規范的藥敏試驗對于感染的治療非常重要，如僅依靠經驗用藥，可能會導致治療效果不佳或治療失敗。

因此，實驗室應在加強臨床溝通的同時對現有菌株鑒定方法進行性能評價，使用不同的鑒定系統快速準確地進行菌種鑒定，積極開展規范的細菌、真菌藥敏試驗，從而為臨床合理用藥提供依據。