安石榴苷對UVB誘導HaCaT細胞光損傷的保護作用

沈芳銘，尹淑濤，趙沖

中國農業大學 食品科學與營養工程學院， 北京 100083

紫外線是影響皮膚健康的關鍵環境因素之一。長期的紫外線暴露不僅可能引起紅斑、色素沉著、免疫抑制等急性損傷，還可能誘發光老化、皮膚癌等慢性損傷[1-2]。能夠穿越臭氧層到達地球表面的紫外線包括320～400 nm的長波紫外線(UVA)和280～320 nm的中波紫外線(UVB)[2]。UVB是主要的生物效應誘發因子，具有比UVA更強的遺傳毒性和皮膚損傷能力[3]。UVB的光子能量可被皮膚表皮角質形成細胞直接吸收，其通過誘導同一條鏈上相鄰堿基之間生成環丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產物(6-4PPs)而導致DNA損傷[4-5]。真核細胞可通過多種途徑修復受損DNA[6]，而紫外線誘導的光損傷產物主要通過核苷酸切除修復(NER)的途徑去除[7]。已有研究[8-12]表明，安石榴苷、白藜蘆醇、番茄紅素、單寧酸、蘆薈甾醇等天然活性成分能夠保護UVB誘導的皮膚損傷。其中安石榴苷是石榴果皮多酚中最主要的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生理活性[12]，將安石榴苷與納米二氧化鈦復配添加到化妝品基質中可發揮優良的防曬效果[13]；
在3D皮膚模型中，安石榴苷能降低酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，具有美白作用[14]；
安石榴苷預處理可抑制UVB照射所致的人正常皮膚永生化角質形成細胞(HaCaT細胞)凋亡[15]。目前已有研究主要集中于安石榴苷對皮膚的直接作用效果，將其作為膳食活性成分攝入、經腸道吸收后能否發揮對皮膚的保護作用尚鮮有報道。

UVB既能直接作用于DNA，也能通過產生活性氧(ROS)繼發性地對細胞核及線粒體DNA造成氧化損傷[16]。M.Zahin等[17]研究發現，安石榴苷能抑制苯并[a]芘誘導的DNA加和物的形成，具有較強的抗突變活性。SIRT1蛋白作為一種廣泛表達于哺乳動物體內、高度保守的去乙?；?，參與DNA損傷修復，有利于維護基因組的穩定性[18]。課題組前期研究[19]發現，安石榴苷能增強HaCaT細胞中SIRT1基因啟動子活性，激活NER途徑，去除UVB誘導產生的CPD?；诖?，本文擬建立人結直腸腺癌細胞(Caco-2細胞)與HaCaT細胞腸-皮膚共培養體系，進一步研究安石榴苷經腸道吸收轉運后對UVB誘導皮膚損傷的抑制效果及機制，為研發功效確切、機制明確的食品功能性成分用于防治UVB誘導的皮膚損傷提供理論依據與參考。

1.1 主要材料與試劑

安石榴苷、多聚甲醛、Triton-X100、甲醇、Tris-HCl緩沖液(pH值為6.8)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、2-巰基乙醇(2-ME)，美國Sigma公司產；
Caco-2細胞、HaCaT細胞、293T細胞，日本理研生物資源中心產；
DMEM完全培養基，日本Nissui公司產；
胎牛血清、山羊血清，美國Life Technologies公司產；
帶細胞培養小室的24孔Transwell培養板(3470型)，美國Corning公司產；
慢病毒表達質粒pSUPER.retro.puro、輔助質粒pVSV-G、pGag-pol，美國OligoEngine公司產；
HilyMax試劑、Hoechst 33342溶液，日本Dojindo Molecular Technologies公司產；
聚凝胺、蛋白G磁珠，美國Merck Millipore公司產；
嘌呤毒素，美國Enzo Life Sciences公司產；
CPD抗體(#NMDND001)，日本Cosmo Bio 公司產；
Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG抗體(A-21422)，美國Life Technologies公司產；
高純度RNA分離試劑盒，日本Roche公司產；
ReverTra Ace qPCR RT試劑盒，日本Toyobo公司產；
KAPA SYBR Fast qPCR試劑盒，美國KAPA Biosystems公司產；
Acetylated-Lysine抗體(#9441)、辣根過氧化物酶標記的馬抗小鼠IgG抗體(#7076)，美國Cell Signaling Technology公司產；
XPA抗體(ab65963)，英國Abcam公司產。

1.2 主要儀器與設備

311型細胞培養箱，美國Thermo Fisher Scientific公司產；
Millicell-ERS-2型細胞電阻儀，美國Millipore公司產；
CL-1000型紫外交聯儀，美國UVP公司產；
IN Cell Analyzer 1000活性細胞熒光顯微圖像獲取及分析系統，英國GE Healthcare公司產；
TP-800型實時熒光定量PCR儀，日本Takara公司產；
LAS-1000 Lumino型圖像分析儀，日本Fujifilm公司產。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養Caco-2細胞及HaCaT細胞均采用含10%(如無特指，文中百分數均指體積分數)胎牛血清的DMEM完全培養基，于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養2～3 d，以適宜比例傳代，選取處于對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3.2 單層Caco-2細胞模型的構建和評價將Caco-2細胞以2×105CFU/mL、每孔250 μL接種于24孔Transwell培養板的細胞培養小室中，培養板下室加入750 μL DMEM完全培養基，根據培養液狀態適時更換培養基。另設不接種Caco-2細胞的空白對照組，在Transwell 培養板的上室和下室均加入相應體積的DMEM完全培養基。

通過細胞單層跨膜電阻(TEER)判斷Caco-2細胞是否形成緊密完整的腸上皮樣單層。單層Caco-2細胞兩側的電阻通過細胞電阻儀測定，根據下式計算TEER。

TEER=(Rsample-Rblank)×S

式中，Rsample為樣品組電阻/Ω，Rblank為空白對照組電阻/Ω，S為細胞培養小室有效膜面積(0.3 cm2)。

1.3.3shSIRT1-HaCaT細胞模型的構建參考文獻[19]的方法構建shSIRT1-HaCaT細胞模型。將含有SIRT1特異性序列的短發卡(Short Hairpin，sh)RNA(序列見表1)克隆至慢病毒表達質粒pSUPER.retro.puro中。在HilyMax試劑作用下，將構建的表達載體pSUPER-puro-shSIRT1與pVSV-G、pGag-pol共同轉染293 T細胞以制備病毒上清液。將293 T細胞分別經含10%和2%胎牛血清的DMEM培養基各培養24 h后，收集含有慢病毒顆粒的上清液。將HaCaT細胞用含10 μg/mL 聚凝胺的病毒上清液于37 ℃條件下感染24 h后，在HaCaT細胞中加入3 μg/mL嘌呤毒素，3 d后篩選得到穩定的shSIRT1-HaCaT細胞模型。

1.3.4UVB誘導HaCaT細胞損傷模型的構建及加藥處理課題組前期研究[19]發現，10 μmol/L的安石榴苷對正常HaCaT細胞活力無顯著影響，且可逆轉UVB照射導致的細胞生長抑制，因此，本文選取該濃度進行實驗。單層Caco-2細胞模型構建完成后，將安石榴苷母液用DMEM完全培養基稀釋至10 μmol/L，替換Transwell培養板細胞培養小室中的原培養基，培養48 h后收集下室的培養液，儲存于-80 ℃冰箱中，備用。

將生長狀況良好、處于對數生長期的HaCaT細胞、shSIRT1-HaCaT細胞以適宜濃度接種于35 mm細胞培養皿中。培養24 h后，將各皿中的培養基吸出，添加少量PBS(1×,pH值為7.2～7.4)浸潤細胞，用紫外交聯儀模擬UVB照射，劑量為8 mJ/cm2，24 h后再次進行UVB照射。為保證各組實驗操作的一致性，無需進行紫外線照射的實驗組仍需模擬UVB照射過程，用錫箔紙覆蓋避光。2次UVB照射結束6 h后，棄去舊培養基，各皿中加入回收的單層Caco-2細胞模型中下室的培養液(需提前預熱)，繼續培養48 h后進行后續實驗。

1.3.5 安石榴苷對UVB誘導HaCaT細胞產生CPD的抑制作用評價參考M.Udono等[20]的方法進行免疫熒光測試。將HaCaT細胞接種于熒光黑色平板中，培養過夜。第2 d從培養箱中取出平板，吸除原培養基。4%多聚甲醛固定15 min后，用冰冷甲醇浸沒細胞，冰上孵育10 min，隨后用含5%山羊血清和0.3%Triton-X100的封閉液室溫封閉1 h。吸除封閉液后，加入一抗(CPD抗體)4 ℃孵育過夜，而后加入二抗(Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG抗體)室溫孵育1 h。用Hoechst 33342溶液在室溫條件下避光孵育10 min，用IN Cell Analyzer 1000獲取細胞圖像，用Multi-Target Analysis Tool進行成像數據分析，用Spotfire DecisionSite Client v.8.2進行可視化處理。

1.3.6HaCaT細胞內XPC基因轉錄水平的測定參考文獻[19]的方法測定細胞著色性干皮病基因組C(XPC)的mRNA轉錄水平。按照高純度RNA分離試劑盒說明書上的步驟提取細胞RNA，利用ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒逆轉錄合成cDNA，參照KAPA SYBR Fast qPCR試劑盒說明書配制反應體系，隨后進行聚合酶鏈式反應(PCR)。實驗重復3次，以β-actin作為內參基因。XPC和β-actin基因的PCR堿基序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.7HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降臏y定參照1.3.4進行實驗，隨后收集各組細胞，按照文獻[19]的方法進行免疫沉淀實驗。用預冷的NP-40裂解緩沖液進行細胞全蛋白提取，在提取的總蛋白中加入Acetylated-Lysine抗體，4 ℃孵育過夜，形成免疫復合物。加入蛋白G磁珠捕獲抗體及其結合的蛋白，4 ℃孵育過夜。用樣品緩沖液(1 mol/L Tris-HCl(pH值為6.8),10%SDS,10%2-ME)洗脫免疫沉淀，采用蛋白免疫印跡法分析樣品。用質量分數12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳100 min，隨后將蛋白質轉移到Hybond-P蛋白雜交膜上，室溫條件下封閉2 h，加入XPA抗體于4 ℃條件下孵育過夜，而后加入二抗(辣根過氧化物酶標記的馬抗小鼠IgG抗體)在室溫條件下孵育1 h。用ImmunoStar LD化學發光法測定蛋白乙?；?，用圖像分析儀進行可視化處理。

1.4 統計分析

采用軟件SPSS 19.0處理實驗數據，結果以(平均值±標準差)表示，用T檢驗進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。利用軟件GraphPad Prism 8作圖。

2.1 單層Caco-2細胞模型的TEER分析

Caco-2細胞在體外培養的條件下可自發分化形成緊密的單細胞層組織，具有小腸微絨毛結構和各種營養物質轉運載體，是理想的腸道吸收模型[21]。TEER可在一定程度上反映單層Caco-2細胞的緊密性與完整性[22]。本研究分別在Caco-2細胞接種后第3 d、第14 d進行TEER的測定。當TEER達到約 800 Ω·cm2的穩定讀數時，即可認為Caco-2 細胞模型已完全分化[23]。單層Caco-2細胞的TEER測定結果如圖1所示，其中***表示組間差異極顯著(P<0.001)，下同。由圖1可知，Transwell培養板上的Caco-2細胞培養至14 d時，TEER為(2350±140) Ω·cm2，表明細胞已形成完整的致密單層，模型建立成功，可進行腸-皮膚共培養體系的構建。

圖1 單層Caco-2細胞模型的TEER測定結果Fig.1 TEER assay of monalayer Caco-2 cells

2.2 安石榴苷對UVB誘導HaCaT細胞產生CPD的抑制作用分析

CPD和6-4PPs是UVB誘導產生的主要光損傷產物，其中CPD占比約70%～80%[24-25]，是哺乳動物細胞中紫外線誘導突變的主要原因[26]。F.Afaq等[27]研究發現，在UVB照射前，用石榴汁或石榴提取物(均含有包括安石榴苷在內的多酚類物質)分別在人體再造皮膚上進行預處理，均可顯著減少CPD陽性細胞的數量，其作用機制與石榴衍生物的抗氧化活性和對DNA損傷修復的促進作用相關。UVB照射后，安石榴苷對HaCaT細胞內CPD水平的影響如圖2所示。由圖2a)可知，UVB照射使對照組的CPD陽性細胞(紅色)比例從24%增加到31%，說明本研究所采取的UVB照射方式能夠誘導光損傷產物的形成。安石榴苷處理后，CPD陽性細胞比例降低至22%。此外，在未經UVB照射的條件下，安石榴苷處理也能使CPD陽性細胞比例從24%降至15%。此結果與課題組前期在HaCaT細胞模型中的研究結論一致[19]，表明安石榴苷在腸-皮膚共培養體系中模擬腸道吸收后仍能修復UVB誘導的光損傷，且在非紫外線照射條件下，安石榴苷對DNA也具有一定的保護作用。

圖2 安石榴苷對HaCaT細胞內CPD水平的影響Fig.2 Effects of punicalagin on CPD level in HaCaT cells

為探究安石榴苷對CPD的抑制作用是否依賴于SIRT1蛋白的調控，本實驗對UVB照射條件下Mock(空白對照)和shSIRT1-HaCaT細胞中的CPD水平進行了評價，結果見圖2b)。在Mock細胞中，安石榴苷使CPD陽性細胞比例從22%降至7%，慢病毒轉導敲低SIRT1基因顯著消除了安石榴苷對CPD的抑制效果。由此可見，安石榴苷對UVB誘導光損傷的修復依賴于SIRT1蛋白的調控。本實驗在文獻[19]的基礎進一步證明了安石榴苷經單層Caco-2細胞模型轉運后仍可發揮SIRT1蛋白的激活劑作用，促進UVB誘導的光損傷的修復。其原因可能是SIRT1蛋白可負調控p53乙?；⒁种艭-Jun氨基末端激酶的激活，從而減弱紫外線誘導的細胞凋亡[28]，還可通過調控XPC基因轉錄在UVB誘導DNA損傷的修復中發揮作用[29]。

2.3 安石榴苷對HaCaT細胞內XPC基因轉錄水平的影響分析

研究[30]發現，UVB誘導產生的DNA損傷主要通過NER系統進行修復。DNA損傷識別階段，NER系統有全基因組修復(GGR)和轉錄偶聯修復(TCR)2條子路徑[31]。在GGR中，XPC-HR23B蛋白復合物與著色性干皮病基因組E蛋白(XPE蛋白)通過識別 DNA 損傷位點啟動修復反應[32]。安石榴苷對HaCaT細胞內XPC基因的mRNA轉錄水平影響如圖3所示。由圖3可知，安石榴苷顯著上調了XPC基因的轉錄水平，這表明安石榴苷經單層Caco-2細胞模型吸收轉運后可通過增強XPC基因的表達促進光損傷的修復。有研究表明，氧化應激會抑制NER途徑對DNA損傷的修復[33]，NER途徑的激活與抗氧化活性相關[34]，而安石榴苷作為SIRT1蛋白的激活劑，對光損傷修復的促進作用可能是由于其較強的抗氧化活性。

圖3 安石榴苷對HaCaT細胞內XPC基因的mRNA轉錄水平影響Fig.3 Effects of Punicalagin on XPC mRNA transcription levels in HaCaT cells

2.4 安石榴苷對HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降挠绊懛治?/h3>

圖4 安石榴苷對HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降挠绊慒ig.4 Effects of punicalagin on the acetylation level of XPA in HaCaT cells

XPA蛋白在DNA損傷驗證環節中發揮作用，并作為分子支架通過蛋白質間的相互作用在損傷位點附近召集其他NER核心因子[35]以完成后續的損傷修復工作。UVB照射條件下，安石榴苷對HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降挠绊懭鐖D4所示。由圖4可知，安石榴苷顯著降低了Mock細胞中XPA蛋白乙?；?；
慢病毒轉導敲低SIRT1基因表達明顯抑制了安石榴苷對XPA蛋白乙?；降挠绊?。綜上所述，在腸-皮膚共培養體系中，安石榴苷以SIRT1基因依賴的方式上調了NER途徑相關的XPA蛋白去乙?；?。這可能是由于UVB照射后，SIRT1蛋白與XPA蛋白結合，使其處于低乙?；癄顟B，從而調節NER途徑[36]。在NER途徑中，DNA損傷被識別后，TFIIH復合物在損傷部位周圍解開DNA鏈，XPA蛋白和復制蛋白A(RPA)分別與DNA的損傷部位和未受損部位結合，允許內切酶結合并切除受損DNA鏈[37]。而SIRT1蛋白對XPA蛋白的調控能增強XPA蛋白與RPA蛋白相互作用的能力[36]，優化NER途徑。盡管本文闡述了安石榴苷在腸-皮膚共培養體系中抑制UVB誘導的光損傷的可能機制，但安石榴苷在經過腸道吸收后是以何種形式作用于HaCaT細胞從而發揮保護作用仍有待深入研究。

本文構建了Caco-2細胞與HaCaT細胞的腸-皮膚共培養體系，發現安石榴苷在經過單層Caco-2細胞模型吸收轉運后仍可促進UVB誘導的光損傷的修復，其作用機制可能與激活NER途徑相關的XPC基因轉錄水平及以SIRT1基因依賴的方式提高XPA蛋白去乙?；较嚓P。本研究為篩選能夠激活SIRT1蛋白的天然活性成分提供了可行的體外模型，并提示了SIRT1蛋白的激活劑在促進修復UVB誘導的皮膚損傷中的重要性，也為安石榴苷作為膳食活性成分的開發提供了理論依據，有利于促進石榴資源的綜合開發利用。后續研究工作將利用動物模型進一步闡明安石榴苷的生物活性和分子作用機制。

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