課題3,酵母細胞固定化

　題 課題 3 酵母細胞的固定化 課題背景 如今，酶已經大規模地應用于食品、化工、輕紡、醫藥等各個領域。在應用酶的過程中，人們發現了一些實際問題：酶通常對強酸、強堿、高溫和有機溶劑等條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產成本：反應后酶會混在產物中，可能影響產品質量。

　于是，有人設想，將酶固定在不溶于水的載體上，使酶既能與反應物接觸，又能與產物分離，同時，固定在載體上的酶還可以被反復利用?，F代的固定化酶技術已完全實現了這一設想。高果糖漿的生產就是固定化酶技術成功地應用于工業生產的實例。

　酶是由細胞合成的，于是，又有人設想，能否將合成酶的細胞直接固定？自 20 世紀 70 年代，在固定化酶技術的基礎上，又發展出了細胞固定化技術。與固定化酶技術相比，固定化細胞制備的成本更低，操作更容易。在本課題中，我們將動手制備固定化酵母細胞，體會固定化酶的作用。

?。ㄒ唬┕潭ɑ傅膽脤嵗?我們以高果糖漿的生產為例來了解固定化酶技術在生產實踐中的應用。高果糖漿的生產需要使用葡萄糖異構酶，它能將葡萄糖轉化成果糖。這種酶的穩定性好，可以持續發揮作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就無法從糖漿中回收，造成很大的浪費。

　使用固定化酶技術，將這種酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些酶顆粒裝到一個反應柱內（圖4-5），柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板上的小孔，而反應溶液卻可以自由出入。生產過程中，將葡萄糖溶液從反應柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過反應柱，與固定化葡萄糖異構酶接觸，轉化成果糖，從反應柱的下端流出。反應柱能連續使用半年，大大降低了生產成本，提高了果糖的產量和質量。目前，用固定化葡萄糖異構酶生產高果糖漿的規模已經超過了每年 1000 萬噸。

　? 高果糖漿是指果糖含量為 42%左右的糖漿。作為蔗糖的替代品，高果糖漿不會像蔗糖那樣誘發肥胖、糖尿病、齲齒和心血管病，對人類的健康更有益。

　 （二）固定化細胞技術 固定化酶和固定化細胞技術是利用物理或化學方法將酶或細胞固定在一定空間內的技術，包括包埋法、化學結合法（將酶分子或細胞相互結合，或將其結合到載體上）和物理吸附法（圖 4-6）。一般來說，酶更適合采用化學結合和物理吸附法固定化，而細胞多采用包埋法固定化。這是因為細胞體積大，而酶分子很??；體積大的細胞難以被吸附或結合，而體積小的酶容易從包埋材料中漏出。

　從操作角度來考慮，你認為哪一種方法更容易？哪一種方法對酶活性的影響更??？固定化細胞固定的是一種酶還是一系列酶？如果想將微生物的發酵過程變成連續的酶反應，應該選擇哪種方法？如果反應物是大分子物質，又應該采用哪種方法？ 本課題使用包埋法來固定細胞，即將微生物細胞均勻地包埋在不溶于水的多孔性載體中。常用的載體有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等。本實驗選用海藻酸鈉作載體包埋酵母細胞（圖 4-7）。

　 實驗操作 （一）制備固定化酵母細胞 1 ．酵母細胞的活化 稱取 1g 干酵母（圖 4-8），放入 50mL 的小燒杯中，加入蒸餾水 10mL，用玻璃棒攪拌，使酵母細胞混合均勻，成糊狀，放置 1h 左右，使其活化（圖 4-9）。

　? 在缺水狀態下，微生物處于休眠狀態?；罨褪亲屘幱谛菝郀顟B的微生物重新恢復正常的生活狀態。

　2 ．配制物質的量濃度為 0.05mol/L 的 的 CaCl 2 溶液 稱取無水 CaCl 2 0.83g，放入 200mL的燒杯中，加入 150mL 蒸餾水，使其充分溶解，待用。

　3. 配制海藻酸鈉溶液 稱取 0.7g 海藻酸鈉，放人 50mL 小燒杯中，加人 10mL 水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌（圖 4-10），將海藻酸鈉調成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至 10mL。注意，加熱時要用小火，或者間斷加熱，反復幾次，直到海藻酸鈉溶化為止。

　 4. 海藻酸鈉溶液與酵母細胞混合 將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入已活化的酵母細胞，進行充分攪拌，使其混合均勻（圖4-11），再轉移至注射器中。

　5. 固定化酵母細胞 以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl 2 溶液中，觀察液滴在 CaCl 2 溶液中形成凝膠珠的情形（圖 4-12）。將這些凝膠珠在 CaCl 2 溶液中浸泡 30min 左右。如果沒有注射器，可以在小塑料瓶上安裝一個孔徑為 2mm的噴嘴來使用。

　 （ 二 ）

　用固定化酵母細胞發酵 1．將固定好的酵母細胞（凝膠珠）用蒸餾水沖洗 2-3 次。

　2．將 150mL 質量分數為 14%的葡萄糖溶液轉移到 240mL 的錐形瓶中，再加入固定好的酵母細胞，置于 25℃下發酵 24h（圖 4-13）。

　操作提示 海藻酸鈉在水中溶解的速度較慢，需要通過加熱促進其溶解。溶解海藻酸鈉，最好采用小火間斷加熱的方法。例如，加熱幾分鐘后，從石棉網上取下燒杯冷卻片刻，并不斷攪拌，再將燒杯放回石棉網繼續加熱，如此重復數次，直至海藻酸鈉完全溶化。如果加熱太快，海藻酸鈉會發生焦糊。

　結果分析與評價 1.觀察并描述形成的凝膠珠的顏色和形狀。

　2.觀察利用固定化酵母細胞發酵的葡萄糖溶液，看看是否有氣泡產生，聞聞是否有酒味。

　課堂延伸 如果希望反復使用固定化酵母細胞，就需要避免其他微生物的污染。在工業生產中，細胞的固定化是在嚴格無菌的條件下進行的。

　結合專題 2 的無菌操作技術，想一想如果要求制作反復使用的固定化酵母細胞，應該在實驗過程中注意哪些問題？ 相關鏈接 結合專題 1 中的課題 1，想一想，是否可以利用固定化細胞發酵制果酒和果醋，使用固定化細胞能否達到連續生產的目的？有興趣的同學不妨試一試。

　練習 1.直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化細胞催化反應，各有哪些優點與不足？ 2.你能寫一篇短文，描述葡萄糖分子通過固定化酵母細胞轉變成酒精的過程嗎？ 3.目前，還沒有一種固定化技術能普遍適用于所有的酶。在實際應用中，需要根據各種酶的特性，探索最佳的固定化途徑。你能解釋為什么很難找出一種普遍適用的固定酶的方法嗎？

　資料 使用須知

　 從近幾年的新課標卷高考真題來看，國家考試中心的命題專家十分重視人教版的教材，例如 2015年課標 II卷的“端粒”，2014 年課標 I卷的“細胞核的功能是”，2014年課標 II 卷的“非特異性免疫的特點是”和“效應 T 細胞的作用是”等等。不夸張的說，人教教材肉眼可見的內容都可能成為命題的素材。高三的最后一個月，地球人都知道要回歸教材，但是怎么回歸，這是個難題？漢水丑生認為，把課本的原文挖成空讓學生填，不失為一種好方法。要是有教材的 WORD版該多好啊，該多好，該多好啊。。。。。。

　于是有了這次公益活動，人教教材的 WORD版提供給大家之后，至于怎么挖空，在哪挖空，這是個仁者見仁的事，就不統一組織了，大家自己發揮主觀能動性吧。

　說明：資料有風險，使用需謹慎。由于人力有限，人教教材 WORD版肯定還存在一些校對方面的問題，請大家使用的時候多留個心眼。

　特別說明：本次活動的作品為漢水群 70 余位紅領巾的公益作品，切勿用于商業用途。

　 老司機：漢水丑生

　2016 年 4 月 27 日