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摘要 革胡子鯰生長快、抗病力強，是我國南方重要的水產養殖品種。應用逆轉錄和套式PCR方法從革胡子鯰（Clarias lazera）肝臟組織RNA中擴增出抗菌肽hepcidin基因cDNA片段，并克隆測序。序列全長233bp，該序列與另外6種淡水和海水魚類的hepcidin序列進行了比較，序列同源性介于45.7％～76.6％之間，平均值為63.25％，說明克隆得到的hepcidin片斷序列是正確的。這為研究革胡子鯰的抗病機理和hepcidin抗菌肽的開發利用提供了基礎。
關鍵詞 革胡子鯰；hepcidin；基因克隆
中圖分類號 S965.1281.6 文獻標識碼A文章編號1007-5739（2008）11-0265-02
革胡子鯰（Clarias lazera）屬鯰形目、胡鯰科、胡鯰屬，是我國重要的淡水養殖品種之一，目前已在我國南方10多個省市普遍養殖。革胡子鯰病害少，抗病力強，對養殖水體條件要求不高，能在污水環境中長期養殖也不易發病并正常生長，耐低氧，食性獨特，喜食其他動物內臟及腐爛的尸體，表現出極強的抗病特性。魚類抗菌肽與其抗病能力密切相關，而hepcidin是種類繁多的抗菌肽中一種重要的免疫因子。本研究應用RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉錄聚合酶鏈反應）技術得到了革胡子鯰體內的hepcidin基因cDNA片斷，并測定其序列，為今后進一步探討其免疫抗病機理以及通過基因工程方法合成hepcidin開發免疫制劑奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
試驗魚：革胡子鯰活魚購自南寧市五里亭農貿市場。
宿主菌和質粒：大腸桿菌E.coli DH5a為廣西大學遺傳育種實驗室保存?？寺≠|粒pMD18-T Vector購于寶生物（TaKaRa）大連生物工程有限公司。
酶和主要試劑：RNA PCR Kit（AMV） Ver 3.0試劑盒，Trizol試劑、質粒小量提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ均購自寶生物（TaKaRa）大連生物工程有限公司；其他試劑為國產分析純。
引物：由上海鼎安生物科技有限公司合成。
1.2方法
引物設計：根據GenBank中鯰形目魚類hepcidin基因的編碼序列設計并合成2對特異性引物。外引物：上游F1： 5"-AAGAAGCAGCAGAAGAAGGAGAACC和下游F2：5"-TTAGAACCTGCAGCAGAACCCAC；內引物：上游F3：5"-CGCGTGCGCCGTCATCGTCATC和下游F4：5"-TCATT CAGCAGTTGCAGCAGAAT。
總RNA的提?。涸囼烎~運回實驗室后處死，迅速從腦顱內取出腦垂體，立即用Trizol試劑提取總RNA，并電泳檢測總RNA的完整性。
目的基因片斷的RT-PCR：按RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0試劑盒說明的方法合成單鏈cDNA。然后以該單鏈cDNA為模板進行套式PCR。2次PCR反應條件相同，具體條件為：94℃預變性3min；94℃變性40s，63℃退火40s，72℃延伸45s，35個循環；72℃后延伸5min。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結果。
目的基因片斷克?。簩CR產物與pMD18-T載體用T4 DNA連接酶進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，涂布含有50mg/L的氨芐青霉素（AMP）LB平板培養。用BamH I、Sal I雙酶切法和PCR法篩選鑒定陽性克隆。
序列測定：將經過陽性鑒定的菌液送上海鼎安生物科技有限公司進行測序。
序列分析：用DNAStar軟件包的MegAlign程序進行序列的同源性分析。
2結果
2.1目的片斷RT-PCR擴增和cDNA克隆
RT-PCR擴增結果如圖1。通過2次PCR，最后得到長度為230bp左右的單一特異性片段。
目的片斷經與pMD18-T載體連接后，成功轉化到大腸桿菌DH5a。陽性克隆的重組子經雙酶切鑒定，證明外源片段成功插入載體。此外，重組子經PCR鑒定，證明該質粒是含有外源目的片斷的陽性重組子。
2.2目的基因片斷序列測定
測定的革胡子鯰hepcidin片斷序列見圖2。序列全長233bp。其堿基組成為：A+T占45.49％，C+G占54.51％。
2.3同其他魚類的hepcidin基因序列比較
將本研究得到的基因序列與其他6種魚類的hepcidin基因序列進行堿基的同源性比較，統計得到了不同種類間的遺傳距離，見表1。這幾種魚類是：科的斑點叉尾（Ictalurus punctatus，Ip），鲿科的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco，Pf），鯉科的斑馬魚（Brachydanio rerio，Br），鮭科的虹鱒（Oncorhynchus mykiss，Om），鯛科的真鯛（Pagrosomus major，Pm），科的花鱸（Lateolabrax japonicus，Lj）[1]。
3討論
本研究所得到的革胡子鯰hepcidin序列，與6種不同科屬魚類間的同源性平均達到了63.25％。與同為鯰形目魚類的斑點叉尾鮰和黃顙魚的序列同源性分別高達93.20％和76.60％。因此，可以肯定本研究獲得的hepcidin基因序列是正確的。
hepcidin是進化中非常保守的基因，在不同物種間，其基因序列和結構高度保守。Hepcidin不僅具有抗細菌、真菌和抗病毒作用，而且是機體調控鐵離子平衡穩態的一種重要調節因子[2]。目前，已在多種魚蝦體內檢測到hepcidin基因的轉錄和表達，并進行了提純。另外，水生動物的hepcidin抗菌肽一般具有廣譜的抗菌作用，熱穩定性、水溶性好，無毒副作用和細菌耐藥性。非常適合開發成肽類抗菌藥和環保型飼料添加劑[3]。對于hepcidin的開發應用現已成為相關領域的熱點。本研究率先克隆得到革胡子鯰的hepcidin基因片斷，為克隆其cDNA全長序列和應用開發奠定了基礎。
4參考文獻
[1] 王克堅，周紅玲，楊明.海水養殖鱸魚分離出一種Hepcidin抗菌肽新基因[J].廈門大學學報（自然科學版），2004，43（3）：66.
[2] PIGEON C，HYIN G，COURSELAUD B，et al.A new mouse liver-specific gene，encoding a protein homologous to human antimicmbial peptide hepcidin，is overexpressod during iron overload[J].J Biol Chem，2001，276（11）：7811-7819.
[3] 田萍.抗菌肽在畜牧生產上的應用[J].廣東畜牧獸醫科技，2004，29（4）：21-22.
注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文?！?/p>
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