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摘 要：當前我國的高密度水產養殖模式造成底質環境惡化，不利于水產養殖的可持續發展，因此研究水產養殖的底質控制和改良技術顯得非常重要和迫切。本文在參考其他方法的基礎上，通過利用微生物和酶來轉化池塘底泥和降低有機碳的含量，以有效控制集約化養殖池塘中的碳源污染。研究顯示，采用0.625 mg·cm-3的用量，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10 d內均對底泥的TOC有一定的降低作用。但微生物和酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其中地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、淀粉酶和纖維素酶按1∶1∶2∶1比例的組合效果最佳，對底泥TOC的降低率高達23.8%。在溫度和DO適宜的條件下，上述配方的菌酶制劑按6.75 kg·hm-2的用量，30 d內可降低池塘底泥厚度0.47 cm，底泥中有機碳含量的降低率達21.82%。研究表明，利用菌酶復合制劑對集約化養殖池塘進行處理，可減少底泥的產生量，降低有機碳的含量，減少碳排放，且菌酶復合制劑的每公頃實際使用成本僅為825元，具有良好的環境效益、經濟效益和社會效益，有一定的推廣價值。
關鍵詞：微生物；酶；水產養殖；底質；總有機碳；控制
中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.006
池塘養殖是我國淡水養殖的傳統方式，在我國的漁業經濟中占主導地位。但是，為了獲取更高的經濟利益，養殖者常采用高密度、高投餌的養殖方式，使得養殖生物的代謝產物、殘餌等大量有機物質沉積于池塘底部，造成底質環境惡化。大量有機底質的存在，不但增加了池塘的碳源，又易引發二次污染，嚴重影響水域生態環境，不利于池塘養殖的可持續發展[1-4]。因此，有必要研究池塘養殖的底質控制技術和環境改良技術，對養殖池塘生態環境進行凈化和優化，以實現池塘養殖的可持續發展。
近年來，我國池塘養殖水體底質環境的控制和修復的各項技術發展很快，出現了諸如物理技術、化學技術、微生態技術及綜合技術等多種技術[5-8]。但應用微生物菌酶技術來控制養殖水體中底泥及有機碳的研究尚未有報道。為了探索好氧—兼性細菌組合復配生物酶來轉化池塘底泥和降低有機碳的功能，本試驗在已完成相關菌株篩選的基礎上，以池塘養殖羅非魚為主要養殖模式，研究利用微生物和酶來控制有機碳的碳匯養殖方式，為合理有效控制集約化養殖池塘中的碳源提供理論依據。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
1.1.1 試驗池塘及養殖生物 試驗池塘采用某水產養殖公司的標準化魚類養殖池塘，共8個池塘，其中對照池1個，試驗池3個，設2組平行。每個池塘的面積為6 670 m2，水深1.5 m。試驗于2014年6月30日開始，7月29日結束，共計30 d，試驗期間平均水溫為（29.3±1.8） ℃。每個池塘中養殖的品種均為奧利亞羅非魚（Oreochromisco aureus），各池塘中養殖魚類的規格、數量基本一致。每667 m2放養的羅非魚數量為2 500尾，規格為每尾50 g左右。試驗期間養殖管理措施一致且不換水。
1.1.2 微生物菌株及生物酶 試驗用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心提供；淀粉酶（5 000 U·g-1）、纖維素酶（（20 000 U·g-1）由無錫杰能科生物技術有限公司提供。
1.1.3 儀器與試劑 所用化學試劑為硫酸、硫酸汞、重鉻酸鉀、葡萄糖、氯化鈉等，均為分析純，國藥集團上海試劑廠產品；牛肉膏、蛋白胨等生化試劑為北京陸橋技術有限責任公司產品。
所用儀器為pH計、ZHJH-1214雙面氣流式無菌工作臺（上海智誠公司），Autoclave SS-325型全自動高壓滅菌器（TOMY公司），MIR-153型高低溫恒溫培養箱（SANYO公司），ZHWY 200B恒溫振蕩搖床（上海智誠公司）， AL204電子分析天平（METTLER-TECEDO公司），冰箱（三星電子公司），721分光光度計（上海第三分析分析儀器廠），7530紫外分光光度計（Agilent公司），Nikon顯微鏡，全自動控溫型養殖系統等。
1.2 方 法
1.2.1 微生物菌粉的制作 地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均采用肉湯培養基（蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1 水1 L，調節pH值 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用）培養。從試管斜面上取一環菌苔，接種到10 mL滅菌的肉湯液體培養基中，于30 ℃、100 r·min-1搖床上培養24 h，培養至對數生長期，再將該菌液接入已滅菌的250 mL肉湯培養基中，同樣條件下培養24～48 h，當活菌數>5×109 CFU·mL-1時，將菌液按重量比1∶4的比例吸附于超細膨潤土粉上，低溫干燥后成為菌粉，活菌含量不低于109 CFU·g-1。
1.2.2 微生物菌及生物酶組合的篩選 將養殖池塘的底泥取回實驗室，放入全自動控溫型養殖系統（內含規格為100 cm×60 cm×50 cm的玻璃水族箱32個）的水族箱中，鋪滿水族箱底部，泥層厚度為（8.0±0.3） cm。同時用池塘水將底泥蓋住，上覆水層厚度為（5.0±0.2） cm，DO為（4.2±0.3） mg·L-1，環境溫度為（28±0.5） ℃。為防止試驗時水分的蒸發，每3 d用池塘水補足上覆水深度。將微生物菌、生物酶單獨試驗，并進行不同的組合，設置了15個不同的處理組，詳見表1，同時設置不添加菌和酶的對照組。試驗設置2個平行，研究菌、酶及其復配物對底泥中有機碳的轉化情況，篩選最適宜的菌—酶組合底質凈化劑。
1.2.3 微生物菌及生物酶復配對養殖水體底泥的轉化及有機碳的影響 根據1.2.2中所篩選出的最適菌酶組合，將其應用于養殖生產池塘，探究其底質凈化的能力。為保證菌酶制劑能順利抵達并停留在底質層面，將菌酶組合壓制成直徑為3 cm的片劑，每片的平均質量為15 g。試驗設置3個劑量組，用量為4.50 ，6.75，9.00 kg·hm-2，同時設1個對照組。試驗設2個平行，分別在試驗開始后的0， 15， 30 d，對不同劑量微生物菌—酶組合處理后的養殖池塘底泥進行取樣測試，了解養殖池塘底泥中有機碳的動態變化情況。同時進行水體底泥厚度的分析，了解水體底質環境質量的變動情況，以便尋求最佳的微生物菌酶處理方式。試驗期間底質有機碳的分析方法采用HJ615—2011所規定的重鉻酸鉀氧化—分光光度法[9]，底泥厚度的測量采用下探尺法直接測量。
1.2.4 數據統計與分析 試驗數據使用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。
2 結果與分析
2.1 不同菌酶組合對池塘底質有機碳的轉化
參考目前養殖底質凈化劑的使用情況，試驗采用每個水族箱中添加30 g菌粉、酶或菌酶組合的用量（相當于0.625 mg·cm-3泥的用量），應用不同的菌、酶及其組合來處理養殖底泥，10 d后測定底泥中有機碳的含量，了解微生物或酶及其組合對池塘底泥的轉化情況，具體情況見表1。
由表1可見，在試驗期間，同樣使用0.625 mg·cm-3的量處理池塘底泥，由于采用的處理物質不同，10 d后底泥中的總有機碳含量明顯不同，TOC的去除率相差較大。與對照組相比，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10 d內均對底泥的TOC有一定的去除作用，去除率在4.0%～7.4%。但微生物菌與菌組合或酶與酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其對TOC的去除率為10.0%～15.9%。而微生物菌與生物酶的組合效果則更優異，其不同組合對TOC的去除效果在10.5%～23.8%，特別是地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1組合）的組合效果最佳，對底泥TOC的去除率高達23.8%。這主要與菌酶的不同性質有密切關系。地衣芽孢桿菌是兼性細菌，好氧、微氧條件下均可生長，枯草芽孢桿菌是好氧細菌[10]，故其兩者組合具有在不同DO水平下的作用效果，并且比好氧條件下效果更好。本試驗中因底泥層較薄，上覆水較淺，DO相對較高，為（4.2±0.3） mg·L-1，故效果顯著。同時，由于養殖池塘底質受飼料殘留影響較大，殘餌中碳水化合物（糖類）的含量高達62%[11]，故淀粉酶的效果較好。因本試驗是在底泥離開池塘的條件下開展的，僅針對微生物—酶的效果篩選，故尚需在池塘中進行驗證試驗。
2.2 微生物菌粉及生物酶復配對養殖水體底泥的轉化及有機碳的影響
采用地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合，按4.50，6.75，9.00 kg·hm-2的處理用量處理養殖水體中的底泥30 d，每隔15 d取樣分析養殖池塘底泥的厚度及有機碳TOC的含量，考察微生物—酶組合在控制養殖池塘底泥有機碳中的應用效果。不同試驗組的池塘底質環境情況見圖1和圖2。
由圖1和圖2可見，將菌酶復合制劑按不同的用量加入養殖池塘后，隨著使用劑量的增加，水體底泥中的有機碳含量在下降，導致了底泥厚度的降低。其中4.50 kg·hm-2試驗組的效果明顯不如另外2個試驗組，但6.75 kg·hm-2和9.00 kg·hm-2試驗組的效果并無顯著性差異?？紤]到經濟有效性，選擇菌酶制劑的用量以6.75 kg·hm-2為宜。在溫度和DO適宜的條件下，6.75 kg·hm-2試驗組經30 d的試驗，可降低池塘底泥厚度0.47 cm，底泥中有機碳的去除率達21.82%，對控制池塘底泥的發生及碳素的釋放具有顯著的功效。
微生物和酶的作用需要有一定的溫度和DO作保證，本試驗的水溫維持在28～31 ℃，底層水體的DO水平在3.2～3.8 mg·L-1間，滿足了不同特性微生物的生長和酶的催化活性，故對底泥及TOC的控制效果較好。
因本試驗是在養殖池塘中進行，無法隨意地控制DO，因此對限制微生物和酶作用效果的最低DO水平無法評估，需要在以后的研究中加以完善。
2.3 菌酶復合制劑的經濟效益分析
為使本研究的研究成果具有推廣價值，故對使用菌酶復合制劑的經濟效益進行分析和評估。上述試驗表明，用于處理池塘底泥污染的菌酶制劑的適宜用量為6.75 kg·hm-2，30 d內具有較顯著的效果。如果每30 d使用1次，1個養殖季節（以6個月計）1公頃水面的池塘用量為40.5 kg。根據實際的比例，其中淀粉酶為16.2 kg、纖維素酶8.1 kg、地衣芽孢桿菌8.1 kg 、枯草芽孢桿菌8.1 kg 。其中的主要成本來自2個酶，淀粉酶的價格為每28元·kg-1，纖維素酶為35元·kg-1。而菌粉成本相對較低，僅為5元·kg-1。故菌酶復合制劑在一個養殖季節中的實際使用成本僅為825元·hm-2，遠低于目前的化學性底質改良劑使用成本。
試驗結果表明，利用菌酶復合制劑對集約化養殖池塘進行處理，可減少底泥的產生量，降低有機碳的含量，減少碳排放，具有良好的環境效益、經濟效益和社會效益，有一定的推廣價值。
3 結 論
（1）采用0.625 mg·cm-3的用量，應用不同的菌酶組合處理養殖底泥，10 d后測定底泥中有機碳的含量。與對照組相比，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10 d內均對底泥的TOC有一定的去除作用。但微生物和酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其中地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合效果最佳，對底泥TOC的去除率高達23.8%。
（2）采用地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合，按4.50，6.75，9.00 kg·hm-2的處理用量處理養殖水體中的底泥30 d，隨著使用劑量的增加，水體底泥中的有機碳含量在下降，導致了底泥厚度的降低。菌酶制劑的用量以6.75 kg·hm-2為宜。在溫度和DO適宜的條件下，6.75 kg·hm-2試驗組經30 d的試驗，可降低池塘底泥厚度0.47 cm，與對照組相比TOC的去除率達21.82%，對控制池塘底泥的發生及碳素的釋放具有顯著的功效。
（3）利用菌酶復合制劑對集約化養殖池塘進行處理，可減少底泥的產生量，降低有機碳的含量，減少碳排放，且菌酶復合制劑的實際使用成本僅為825元·hm-2，具有良好的環境效益、經濟效益和社會效益，有一定的推廣價值。
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