草魚纖維素酶活性的研究

材料與方法

2.1 試驗材料

草魚購于萊西水溝頭市場，共26尾，體長30-45cm，體重0.996-2.107kg。土霉素通用名為鹽酸土霉素，規格含量為1g（100萬IU），由四川齊全動物藥業有限公司生產。

2.2 試驗設計

2.2.1纖維素酶在草魚體內的分布研究實驗設計

目的是探討草魚體內有無纖維素酶，以及在不同器官（前腸、中腸、后腸、脾臟、肝胰臟、膽汁）中纖維素酶的分布情況。本實驗取4尾魚，將前腸、中腸、后腸、脾臟、肝胰臟、膽汁取出，稱重，制取酶液。每個樣品3次重復。采用羧甲基纖維素鈉法測定纖維素酶活力大小。

2.2.2 纖維素酶的適宜反應條件研究實驗設計

購買魚16尾，暫養于水族箱2h后取其內臟，分別稱重并記錄，制取酶液。每個樣品3次重復。纖維素酶活力測定方法同上。

2.2.3 纖維素酶來源初步研究實驗設計

土霉素屬四環族抗菌素，是一種廣譜抗菌藥，可抑制腸道中的微生物。因此，以灌喂蒸餾水作為對照組，通過灌喂土霉素測定腸道中纖維素酶活力的變化情況，對纖維素酶來源進行初步探討。共取6尾魚灌喂，分別灌喂土霉素和蒸餾水，3h后取樣，灌喂量為1000ppm，1ml/50g魚體重土霉素，蒸餾水劑量同土霉素。

2.3 酶液的制備

健康的草魚成魚從市場上買回，實驗前暫養于水族箱中2h后取樣。在冰盤中解剖活魚，取出內臟，置于碎冰中（保持在0-4℃狀態下）.從肝胰臟、脾臟組織中隨機取出一部分組織塊，在電子天平（0.1mg）上稱重;取出膽囊，將膽囊表面的脂肪及其他組織剔除干凈，用蒸餾水沖洗膽囊外壁，再用脫脂棉球拭干，刺破囊壁，取出膽汁，稱重;除去腸道內容物，用重蒸水洗凈腸內壁，再用濾紙小心將多余水分吸干，分別稱重。將所取樣品分別加5倍重量的預冷重蒸水，在0～4℃玻璃勻漿器勻漿（膽汁除外）后，3500r/min離心20min，取上清夜作為粗酶提取液，置-40℃冰箱中冷凍保存，備用。

2.4 纖維素酶活性測定方法和原理：

纖維素酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。測定原理是羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）經纖維素酶作用后，生成還原糖，可與3，5-二硝基水楊酸（DNS）生成紅色絡合物，用比色法測定還原糖的多少，即可確定纖維素酶的活力。酶活單位的表示方法是：活性大小以每mg組織24℃每分鐘催化纖維素生成葡萄糖（μg）表示（μg/min）。

2.5 標準曲線的繪制

精確稱取分析純的無水葡萄糖250.0000mg，溶于蒸餾水中，定容至250毫升，吸取此液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml，分別定溶至50ml，再分別吸取上述溶液各2.5ml于試管中，各加3ml 3，5-二硝基水楊酸，煮沸15min，（另作一管對照，取2.5ml蒸餾水，3ml 3，5-二硝基水楊酸，同樣煮沸5min）。冷卻后，用72型分光光度計，在530nm波長下比色，記錄各管的光密度讀數，以光密度作橫坐標，繪制標準曲線，（糖液分別含糖0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg）。

2.6 纖維素酶活性的測定

活酶活性測定：加pH=5的檸檬酸緩沖液3ml，CMC溶液2ml，酶液2ml（1ml），置于24℃水浴鍋中糖化30min，取出后立即于沸水浴中煮沸15min，冷卻后3000r/min離心10min，取1ml糖化液的上清夜加入3，5-二硝基水楊酸顯色液3ml，于沸水浴中煮沸顯色15min，冷卻后加重蒸水6ml（3ml），530nm處測葡萄糖含量。

死酶活性測定：取2ml（1ml）酶液置于沸水浴中加熱10min，冷卻后加入pH=5的檸檬酸緩沖液3ml，CMC溶液2ml，酶液2ml（1ml），置于40℃水浴鍋中糖化30min，取出后立即冷卻后3000r/min離心10min，取1ml糖化液的上清夜加入3，5-二硝基水楊酸顯色液3ml，于沸水浴中煮沸顯色15min，冷卻后加重蒸水6ml（3ml），530nm處測葡萄糖含量。

吸取1ml蒸餾水，加入3，5-二硝基水楊酸顯色液3ml，于沸水浴中煮沸15min，冷卻后加重蒸水6ml（3ml）作為空白對照組，與試驗管一起保溫比色。

讀出光密度，在標準曲線上查出還原糖量，并計算出酶活力。

2.7 纖維素酶活性的計算公式

Cx酶活力=B×A×1000/30min=（還原糖）μg/min

B—從標準曲線上查得的葡萄糖毫克數

A—酶液稀釋倍數

2.8 統計方法

采用SPSS12.0 for Windows 軟件對數據進行統計分析。

3 結果

3.1 纖維素酶在草魚不同器官的活性分布

纖維素酶活性分布順序是肝胰臟>脾臟>腸道>膽汁。在肝胰臟內的活性及其顯著，遠遠高于其他部位。膽汁的活性不明顯。其在腸道的順序后腸>前腸>中腸，但差異不顯著（見表1）。

表1 草魚不同器官纖維素酶的活性單位：μg/min

3.2 溫度對纖維素酶的影響

本實驗測定了20℃到52℃水浴，以4℃為溫度梯度，對纖維素酶進行了研究（見圖1-5）。從圖中可以看出，在這五種器官中隨著溫度的升高，纖維素酶的活性總體呈下降趨勢。在前腸20℃和28℃出現峰值。中腸和后腸均在20℃出現峰值。肝胰臟和脾臟均在24℃時出現峰值。表明20℃-24℃適合纖維素酶活性的發揮。在后面的實驗中可以選擇20℃-24℃作為纖維素酶活性測定的溫度條件。

3.3 pH值對纖維素酶活性的影響

在pH值3.6-7.2，纖維素酶在前腸、中腸、后腸中均有兩個峰值。前腸為6.0和7.2，后腸為6.4和7.2，而在中腸為5.2和6.0（見圖6）。這與腸道的pH值偏于酸性弱堿性是大體相似的。在脾臟其活性最大為6.0，而在5.2時其活性僅次于6.0（見圖7）。pH值為4.8和6.4時，纖維素酶在肝胰臟的活性最大（見圖8）。由此可以認為在酸性環境條件下有利于纖維素酶活性的發揮。

3.4 灌喂土霉素法，初步探討草魚腸道纖維素酶的來源

本實驗采用灌喂蒸餾水作為對照組，以50g魚體重灌蒸餾水1ml為標準;土霉素濃度為1000ppm，

1ml/50g魚體重，灌喂量同對照組。灌喂后3h取樣。后腸纖維素酶活性明顯下降，前腸和中腸的變化不明顯（見圖9）。

4 分析與討論

目前，對魚類消化系統中是否存在纖維素酶尚有爭議。Migita等（1949）曾發現鯽魚（Carassius auratus）消化系統中有纖維素酶活動。吳婷婷等（1994）在鰱，鳙，草魚等魚類均已發現存在纖維素酶活性。沈文英等（2002，2003）對銀鯽纖維素酶進行了有關研究。林浩然認為在一些過河口性魚類的腸道中存在分泌纖維素酶的腸道細菌。最近，對蝦蟹等水產動物中存在纖維素酶進行的大量研究。而Fish（1951）和Barrington（1957）曾認為魚類沒有纖維素酶。

本實驗，在草魚腸道，脾臟，肝胰臟中發現纖維素酶。在肝胰臟中活性很大，脾臟次之，腸道中也有明顯活性。從實驗結果來看，對于草食性魚類飼料中應當添加適量的纖維素。

溫度、pH值對于魚類生理活動的影響是多方面的。沈文英等（2003）研究了魚類消化酶與溫度的關系，認為溫度升高，魚類消化酶活性增強，但此種正相關不是無限的。本實驗結果表明在溫度20℃-28℃之間時，腸道、脾臟和肝胰臟的纖維素酶活性較強。這一結果與草魚的最適生長溫度大致相吻合。而酸堿度的作用一方面是對食物進行酸堿性消化，另一方面是為消化酶提供適宜的酸堿度利于纖維素酶活性的發揮。因此，在人工配合飼料生產中應充分考慮飼料的成分及對其消化利用。本實驗結果腸道在偏酸性、弱堿性時的纖維素酶活性最大，而脾臟、肝胰臟在酸性條件下有利于纖維素酶，以提高飼料成分的消化吸收。

從實驗結果來看，草魚腸道內的纖維素酶既有腸道自身分泌又有其內部微生物產生。前腸和中腸微生物產生不明顯，而后腸灌喂土霉素組與對照組有明顯的差異，說明在草魚的后腸內可能存在分泌纖維素酶的微生物或是能夠刺激纖維素酶產生的細菌，這還有待進一步研究。