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【摘要】 目的：觀察眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）對膿毒癥大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-10（IL-10）的影響。方法：選取清潔級雄性SD大鼠144只，按照隨機數字表法將大鼠分為A組（假手術組）、B組（膿毒癥組）、C組（CVF預處理組），各48只；各組按照標本采集點的不同又分為術后2、4、8、12、16、24 h六個時間點亞組，各8只。B、C組采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制作膿毒癥大鼠模型；C組大鼠在CLP術前靜脈注射CVF，而A、B組靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。觀察術后大鼠一般情況及腹腔情況，比較各組術后不同時間點的TNF-α、IL-6和IL-10水平變化。結果：C組大鼠膿毒癥反應較B組明顯減輕；除術后8 h外，C組術后其他時間點TNF-α水平均低于B組（P<0.05），其中B組術后2 h時TNF-α迅速升高達峰然后下降，但是術后12 h再次升高出現第二個峰值，C組術后4 h較2 h迅速下降，術后8 h再次升高出現第二個峰值；除術后16 h外，C組術后其他時間IL-6水平均低于B組（P<0.01）；除術后2、24 h外，C組血清IL-10水平均高于B組（P<0.05），而且術后8、16 h兩次達到峰值，呈雙峰變化。結論：CVF可以有效維持促炎細胞因子（TNF-α、IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的平衡并明顯抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應，同時TNF-α及IL-10的“雙峰現象”也為免疫平衡理論及PICS提供了理論依據。
【關鍵詞】 膿毒癥； 補體； 眼鏡蛇毒因子； 細胞因子
Effect of Cobra Venom Factor in Inhibiting Complement Activation on Serum Cytokines in Septic Rats/WEI Qiao，SHENG Yaqian，RU Songwei，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（23）：0-035
【Abstract】 Objective：To observe the effect of cobra venom factor（CVF） on TNF-α，IL-6 and IL-10 in peripheral blood of septic rats.Method：A total of 144 male SD rats with clean grade were selected.According to the random number table method，rats were divided into group A（sham operation group），group B（sepsis group） and group C（CVF pretreatment group），48 cases in each group.According to the different collection points，each group was divided into six subgroups（after operation 2，4，8，12，16，24 h），8 cases in each subgroup.The sepsis rats were induced by cecal ligation and puncture（CLP） in group B and C，and the rats of group C received intravenous injection of CVF before CLP，while those of group A and B received equal amount of normal saline intravenously.The general condition and abdominal cavity condition of rats after operation were observed，and the levels of TNF-α，IL-6 and IL-10 at different time points after operation in each group were compared.
Result：The manifestations of sepsis in group C were less severe than those of group B.Except for 8 h after operation，the levels of TNF-αin group C were lower than those of group B（P<0.05）.The levels of TNF-α in group B increased rapidly to peak at 2 h，and then decreased，but increased again to the second peak at 12 h，and the levels of TNF-α in group C decreased rapidly at 4 h compared with 2 h and increased again to the second peak at 8 h.Except for 16 h after operation，the levels of IL-6 in group C were lower than those of group B（P<0.01）.Except for 2 and 24 h after operation，the levels of serum IL-10 in group C were higher than those of group B（P<0.05），and peaked at 8 h and 16 h after operation，which showed bimodal changes.Conclusion：CVF can effectively maintain the balance of pro-inflammatory cytokines（TNF-α，IL-6） and anti-inflammatory cytokine（IL-10），and obviously inhibit the inflammatory response of sepsis rats.The bimodal phenomenon of TNF-α and IL-10 also provides a theoretical basis for the theory of immune balance and PICS.
【Key words】 Sepsis； Complement； Cobra venom factor； Cytokines
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.23.008
膿毒癥以細胞因子及炎癥介質的過度釋放為特征[1]，現在越來越多的研究表明補體系統失控性的過度激活可能是膿毒癥發病機制的關鍵因素之一[2]。補體系統過度激活產生的大量過敏毒素（C3a、C4a和C5a）可激活單核巨噬細胞及中性粒細胞迅速產生大量的炎癥介質從而進一步介導并加重機體的傷害[3-4]。因此抑制補體激活成為膿毒癥救治的一個方向和突破口[5-6]。眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）是一款經典的補體抑制劑，利用其可導致補體耗竭而發揮抑制補體激活的作用。本研究通過盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture，CLP）制作膿毒癥大鼠模型，通過觀察膿毒癥大鼠早期外周血促炎細胞因子中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和抗炎細胞因子白介素-10（IL-10）
等細胞因子的變化，并結合大鼠一般情況及腹腔情況，進一步探討眼鏡蛇毒因子對膿毒癥大鼠的作用?，F報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組 清潔級SD大鼠144只，雄性，每只體重250～300 g（江西中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：JZDWNO：2006-108、JZDWNO：2007-031）。按照隨機數字表法將大鼠分為A組（假手術組）、B組（膿毒癥組）、C組（CVF預處理組），各48只；各組按照標本采集點的不同又分為術后2、4、8、12、16、24 h六個時間點亞組，各8只。A組僅開腹翻動盲腸后關腹；B、C組大鼠開腹后均參照文獻[7]行CLP制作膿毒癥模型；C組于術前24 h按50 μg/kg經陰莖背靜脈注射CVF，A、B組則給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液。術后置籠內自由活動，不禁飲食。
1.2 細胞因子的測定 TNF-α和IL-6含量采用放射免疫分析法測定，藥盒購自北京華英生物技術研究所。IL-10含量采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定，藥盒購自美國R&D公司。觀察術后不同時間點TNF-α、IL-6、IL-10的變化。
1.3 統計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠CVF術后一般情況及腹腔觀察 B組大鼠隨時間延長可見精神逐漸萎靡，呼吸急促逐漸加重，反應逐漸遲鈍，活動逐漸減少，龜縮在一角，極其容易捕捉，豎毛現象逐漸明顯；腹腔滲液顏色逐漸由淡紅色清亮狀逐漸變為褐色渾濁狀，腸粘連現象逐漸明顯。而C組大鼠膿毒癥反應較B組明顯減輕。
2.2 三組術后血清TNF-α水平變化比較 除術后8 h外，A、C組術后其他時間TNF-α水平均低于B組（P<0.05）；術后4 h，C組TNF-α水平低于A組（P<0.05）；另外B組術后2 h時TNF-α迅速升高達峰，然后下降，但是術后12 h再次升高出現第二個峰值；C組也有相似的雙峰變化趨勢，術后
4 h時較術后2 h時迅速下降，術后8 h時再次升高出現第二個峰值。見表1、圖1。
2.3 三組術后血清IL-6水平變化比較 A組術后各時間點IL-6水平均低于B組（P<0.01）；除術后16 h外，C組術后其他時間IL-6水平均低于B組（P<0.01）；除術后12 h外，C組術后其他時間IL-6水平均高于A組（P<0.05）；另外三組術后4 h達峰后均逐漸下降，其中C組介于A、B組間，明顯高于A組（術后12 h除外），但明顯低于B組（術后16 h除外）。見圖2、表2。
2.4 三組術后血清IL-10水平變化比較 術后8、12、16 h，C組血清IL-10水平均高于A、B組（P<0.05），且術 后4 h，C組血清IL-10水平均高于B組（P<0.05）；B組血清IL-10水平一直處于較低水平，各時間點沒有明顯變化；C組血清IL-10分別于術后8、16 h兩次達到峰值，呈雙峰變化。見表3、圖3。
3 討論
作為機體免疫系統的一個非常重要的組成部分，補體系統的適度激活是宿主防御反應的一個重要方面[8]，但當膿毒癥時局限性補體激活變為全身性時，結果常常就不是有益的了[9-10]。由于認識到膿毒癥時補體系統過度激活會對機體造成巨大有害影響，因此許多學者嘗試通過特異性抑制物抑制補體激活從而保護機體[11-12]。Wang等[6]在靈長類膿毒癥模型上注射C1抑制物（C1-INH）后可以改善血流動力學、血液學反應和存活率。魏永軍等[13]研究表明，在制作創傷失血性休克大鼠模型前提前使用CVF預處理可以有效降低內毒素含量，并可以明顯改善預后。本研究顯示，除術后8 h外，A、C組術后其他時間TNF-α水平均低于B組（P<0.05）；術后4 h，C組TNF-α水平低于A組（P<0.05）；除術后16 h外，C組術后其他時間IL-6水平均低于B組（P<0.01）；術后8、12、16 h，C組血清IL-10水平均高于A、B組（P<0.05），且術后4 h，C組血清IL-10水平均高于B組（P<0.05）。結果提示，CVF預處理不僅可以明顯降低膿毒癥大鼠TNF-α、IL-6水平，而且可以明顯提高IL-10水平。同時，大鼠的一般表現及腹腔情況變化也印證了CVF可以明顯減輕大鼠的炎癥反應。因此，CVF抑制補體激活后可以維持膿毒癥大鼠早期促炎和抗炎細胞因子的平衡，有效地減輕了大鼠的全身炎癥反應。
另外本研究發現B組大鼠CLP術后TNF-α立即呈爆發性升高，隨后下降后再次升高達峰，呈現“雙峰現象”，C組也有相似的變化趨勢。本研究中發現的TNF-α的“雙峰現象”與以往其他學者的報道不盡相同，究其原因可能是：（1）血循環與局部組織的TNF-α水平不一致。翟紅霞等[14]研究發現膿毒癥時局部組織與血循環的TNF-α水平不一致，局部組織遠遠高于血循環，局部組織的細胞因子有可能后期釋放入了血循環進而導致雙峰。
（2）各臟器組織TNF-α表達先后不一致。隰建成等[15]研究發現大鼠CLP后受損組織和外周血的中性粒細胞的TNF-αmRNA的表達量明顯增高，另外各臟器組織表達增高的先后順序也不相同，首先是受損局部的創傷組織，比如本實驗中穿孔的盲腸，接著是血循環，最后是肺和肝組織。（3）另外也有學者研究表明，有可能第一峰源于應激，隨著進展大量細菌或毒素進入了循環，而第二峰源于感染，體內的單核巨噬細胞可能對致炎物質產生反應導致形成了第二峰[16-19]。另外C組IL-10也能夠緊隨TNF-α的變化而變化，同樣呈現“雙峰現象”，顯示出良好的反應性和隨動性。雖然TNF-α及IL-10
“雙峰現象”的具體的機制及意義有待進一步研究，不過卻提示膿毒癥時機體的免疫狀態是在不斷地發生變化的，不是一成不變地處于過度炎癥反應或者免疫抑制狀態，這有力地支持了PICS[20]。這也為部分膿毒癥臨床實驗采取抑制炎癥反應卻療效不佳提供了較為合理的解釋[21-22]，從而為免疫治療介入的時機以及免疫平衡理論提供了理論依據[23-24]。
綜上所述，CVF可以有效維持促炎細胞因子（TNF-α、IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的平衡并明顯抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應，同時TNF-α及IL-10的“雙峰現象”也為免疫平衡理論及PICS提供了理論依據。
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（收稿日期：2018-02-07） （本文編輯：董悅）
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