四重PCR檢測抗除草劑轉基因油菜T45

摘要：【目的】建立多重PCR檢測抗除草劑轉基因油菜T45的方法，為其轉基因檢測提供技術支持?！痉椒ā窟x擇油菜內源參照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作為四重PCR檢測基因，特異性引物序列參照國家相關標準或文獻，通過對多重PCR退火溫度和引物濃度的優化、靈敏度測試及已知樣品驗證，建立抗除草劑轉基因油菜T45多重PCR檢測體系?！窘Y果】多重PCR的適宜退火溫度為58 ℃，適宜引物終濃度（μmol/L）配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV 35S∶pat為0.1∶0.2∶0.2∶0.2，方法靈敏度為0.01 ng/μL，所有已知樣品的擴增條帶與其分子特征顯示的外源基因元件完全一致?！窘Y論】建立的抗除草劑轉基因油菜T45品系四重PCR檢測方法可實現在一個反應體系中同時檢測抗除草劑轉基因油菜T45內源參照基因和多個外源基因成分，為轉基因油菜T45提供了一種有效的檢測手段。

關鍵詞： 油菜；多重PCR；毛細管電泳；分子檢測

中圖分類號： S565.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0883-06

0 引言

【研究意義】抗除草劑轉基因油菜T45由德國拜耳公司研發，其轉入基因表達抗草銨膦除草劑的活性成分。T45品系已先后在澳大利亞、加拿大、日本和美國被批準環境釋放，并在我國、歐盟、韓國等8個國家和地區被批準用于食品或飼料加工原料。油菜籽是我國重要的食用植物油原料和飼料蛋白源，但由于供給長期處于短缺狀態，我國每年進口油菜籽達千萬噸，其中60%以上為轉基因油菜籽（張麗等，2012）。除抗除草劑轉基因油菜T45外，我國還允許抗蟲轉基因油菜GT73、MS1等9個轉基因油菜品系進口用作加工原料。隨著轉基因商業化產品不斷增多，其安全性問題受到社會各界的廣泛關注，許多國家和地區制定并實施了相關轉基因產品標識制度（金蕪軍等，2004），而轉基因標識制度的科學執行就必須依托快速、有效的轉基因產品檢測技術。因此，建立快速、有效的轉基因檢測體系對提高檢測效率和降低檢測成本及加強轉基因產品安全管理均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，轉基因特異PCR檢測有4個不同的策略，包括篩選檢測、基因特異檢測、結構特異檢測和轉化事件特異檢測。Yang等（2006）通過TAIL-PCR克隆找到了T45油菜5"端寄主植物的DNA與轉化載體間的連接序列，再利用轉化事件特異檢測策略分別建立了定性和定量檢測抗除草劑轉基因油菜T45方法。聶淑晶（2008）通過基因組步移文庫建立，分離T45油菜左邊界（3"端）及右邊界（5"端）寄主植物的DNA與轉化載體間的連接序列，再利用轉化事件特異檢測策略分別建立了左邊界和右邊界的定性和定量檢測抗除草劑轉基因油菜T45方法。申愛娟等（2014）應用溫度不對稱PCR（TAIL-PCR）擴增獲得轉基因油菜W-4 T-DNA插入位點的左、右旁側序列，依據左、右邊界旁側序列和轉基因載體的T-DNA左右邊界序列設計2對特異性引物TLF/TLR和TRF/TRR，從W-4基因組DNA中擴增出大小分別為485和405 bp的預期產物，據此建立了W-4的轉基因事件特異性PCR檢測技術。多重PCR在轉基因檢測方面的應用也非常廣泛，白月等（2011）用復合PCR結合DHPLC檢測了番茄中的轉基因成分，建立的多重PCR-DHPLC操作簡便，快速準確，能夠同時檢測轉基因番茄4個內、外源基因，檢測限達0.5 ng/μL；何瑋玲等（2012）利用多重 PCR建立了食品中 4種肉類成分的快速鑒別方法；崔學強等（2015）建立了多重PCR鑒定傷口中3種致病菌的方法?！颈狙芯壳腥朦c】目前，多重PCR結合毛細管電泳技術在轉基因玉米及食品轉基因成分檢測中已有相關研究，但在轉基因油菜T45檢測方面未見報道。雖然相關文獻報道和國家標準中已有抗除草劑轉基因油菜T45轉化事件特異檢測方法，但尚未見針對轉化事件中的多個外源基因進行多重PCR并結合毛細管電泳檢測的技術方法?！緮M解決的關鍵問題】根據抗除草劑轉基因油菜T45插入的基因元件，擬建立一種包括油菜內源參照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat的四重PCR檢測技術體系，通過對多重PCR體系的退火溫度、4對引物終濃度配比及方法靈敏度進行優化，并利用已知樣品對檢測體系進行驗證，為抗除草劑轉基因油菜T45檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用轉基因油菜籽T45粉末（含CruA、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、轉基因大豆GTS40-3-2種子粉末（含P-CaMV 35S基因，不含CruA、T-CaMV 35S和pat基因）、轉基因玉米Bt11種子粉末（含P-CaMV 35S和pat基因，不含CruA和T-CaMV 35S基因）、轉基因油菜籽GT73粉末（含CruA基因，不含P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、轉基因油菜籽MS8粉末（含CruA基因，不含P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、轉基因水稻TT51-1種子粉末（不含CruA、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）均由四川省農業科學院質量標準與檢測技術研究所保存并提供。植物基因組提取試劑盒、標準分子量（M）購自天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix購自日本東洋紡（TOYOBO）株式會社；引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1. 2 引物序列

依據抗除草劑轉基因油菜T45的分子特征信息，選擇油菜內源參照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作為四重PCR技術體系的檢測基因，特異性引物序列參照國家相關標準（表1）。將各條引物濃度稀釋至10 μmol/L備用。

1. 3 樣品DNA提取

樣品DNA提取按照天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒說明進行操作，測定樣品DNA濃度并判斷質量。

1. 4 四重PCR的建立

1. 4. 1 單基因特異性 反應體系25.00 μL，包括2×Master Mix 12.50 μL，上、下游引物各1.00 μL，樣品DNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，進行35個循環；72 ℃ 延伸3 min，4 ℃保存。反應產物采用Qiagen毛細管電泳儀對結果進行分析。

1. 4. 2 四重PCR條件優化 利用以下體系和程序對四重PCR退火溫度進行優化。反應體系25.00 μL，包括2×Master Mix 12.50 μL，4組上、下游引物各0.25 μL，樣品DNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度設置6個梯度，分別為50、54、56、58、60和64 ℃，時間均為30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；72 ℃延伸3 min。反應產物采用Qiagen毛細管電泳儀對結果進行分析，選擇適合的退火溫度。

利用以下體系和程序對四重PCR引物濃度進行優化。反應體系25.00 μL，包括東洋紡2×Master Mix 12.50 μL，4對引物終濃度按照表2設置引物濃度梯度，模板DNA 2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。擴增程序選擇退火溫度優化后確定的程序。反應產物采用Qiagen毛細管電泳儀對結果進行分析，選擇適合的引物濃度配比。

1. 5 四重PCR方法靈敏度檢測

將基因組DNA進行梯度稀釋，使每個反應體系中轉基因油菜T45基因組DNA的濃度分別為0.02、0.01、0.005、0.003、0.001和0.0005 ng/μL，利用四重PCR試驗優化后的檢測體系進行方法靈敏度檢測試驗。

1. 6 已知樣品驗證

利用四重PCR試驗優化后的檢測體系，對已知樣品進行驗證。

2 結果與分析

2. 1 樣品DNA提取

樣品總DNA濃度和質量通過NanoDrop 1000（Thermo scientific）超微量分光光度計測定，所有樣品OD260/OD280范圍在1.8～2.0，OD260/OD230大于2.0，濃度均大于25 ng/μL，說明樣品DNA的質量和濃度能滿足PCR擴增要求。最后將樣品DNA的濃度稀釋至25 ng/μL備用。

2. 2 四重PCR單基因特異性驗證

單基因特異性驗證結果（圖1）表明，引物序列分別對4個目的基因片段的擴增具有特異性，無非特異性條帶出現。選擇的引物可用于4個目的基因片段的多重PCR檢測體系研究。

2. 3 四重PCR條件的優化

退火溫度梯度試驗結果（圖2）表明，選擇的50～60 ℃溫度梯度均可擴增到目的條帶，在64 ℃條件下，T-CaMV 35S基因片段未能擴增出條帶。其中，在50 ℃條件下出現了多條非特異性條帶；在60 ℃條件下，T-CaMV 35S基因的目的片段擴增效率明顯低于其他3個基因片段，基因片段間擴增效率不一致。在其他3個退火溫度條件下均可擴增到目的基因條帶，盡管均出現一條540 bp大小的非特異條帶，但并不影響對其他目的基因片段的識別，在考慮所有目的基因片段擴增效率和單基因擴增時的退火溫度等情況下，最終確定四重PCR反應的退火溫度為58 ℃。

引物濃度梯度試驗結果（圖3）表明，各引物終濃度按照方案④配比時，各目的基因片段的擴增效率相對一致；而其他幾種引物濃度配比方案結果均不理想，目的基因片段存在無擴增、擴增效率不一致等現象。最終確定最優化的引物終濃度（μmol/L）配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV 35S∶pat為0.1∶0.2∶0.2∶0.2。

2. 4 四重PCR靈敏度

通過四重PCR靈敏度試驗，結果（圖4）顯示，在模板總量不低于0.01 ng/μL時，均可有效擴增出4個目標片段。當模板總量低至0.005 ng/μL時，雖然幾個基因片段均能得到擴增，但外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat片段擴增量太小，條帶模糊。因此，確定四重PCR檢測體系的靈敏度為0.01 ng/μL。

2. 5 已知樣品驗證

采用建立的四重PCR對已知樣品進行檢測，結果（圖5）表明，T45檢出CruA（151 bp）、P-CaMV 35S（195 bp）、T-CaMV 35S（134 bp）和pat（262 bp）基因片段，GTS40-3-2檢出P-CaMV 35S（195 bp）基因片段，Bt11檢出P-CaMV 35S（195 bp）和pat（262 bp）基因片段， GT73檢出CruA（151 bp）基因片段，MS8檢出CruA（151 bp）基因片段，TT51-1無任何基因片段，所有樣品擴增的目的條帶與預期的基因元件分子特征一致。此結果進一步驗證了建立的四重PCR檢測方法具有可靠性。

3 討論

轉基因產品檢測技術主要有蛋白質和核酸檢測兩類，核酸檢測技術中運用較多的是普通PCR，其具有敏感、快速、簡便的特點，主要用于檢測轉基因作物及產品中的單個外源基因（張富麗等，2009；尹全等，2010）。在產品檢測時，通常需要檢測多個外源基因以確認其所含轉基因成分及是否為轉基因產品，采用普通PCR分別對這些外源基因進行檢測時存在時間和試劑耗費大、操作繁瑣等缺點（鄭景生和呂蓓，2003）；多重PCR只需一個反應和一次電泳即可同時檢出多個目的基因片段，可極大地節約試劑并節省時間（邵碧英和陳文炳，2005）。在毛細管電泳結合多重PCR檢測分析研究方面，周穎等（2007）采用無膠篩分毛細管電泳—激光誘導對三重PCR反應擴增產物進行熒光檢測，建立了多重PCR-毛細管電泳—激光誘導熒光快速檢測轉基因玉米的新方法；張春嬌等（2011）采用毛細管電泳—紫外檢測方法分析了轉基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特異性基因多重PCR產物，建立了轉基因玉米品系特異毛細管電泳—紫外檢測方法。本研究利用毛細管瓊脂糖預制膠電泳技術對多重PCR產物進行分析，建立了四重PCR毛細管電泳檢測抗除草劑轉基因油菜T45方法，節約了模板和試劑，并縮短了檢測時間，具有高效、快速、靈敏且經濟環保的優點。

在建立體系的過程中，考慮到不同引物序列對PCR結果存在較多影響，本研究優先選擇現有國家或行業標準中的引物，這些引物均經過反復試驗及多方驗證，至少單基因PCR可得到保障，有利于多重PCR試驗的進一步開展。引物濃度配比及退火溫度依據目的條帶特異、引物二聚體少，各基因片段擴增效率相對一致的要求（Henegariu et al.，1997），最終確定了四重PCR檢測體系的適宜引物濃度配比和退火溫度。利用建立的四重PCR檢測體系進行靈敏度試驗，最終確定本體系的檢測靈敏度為0.01 ng/μL，略高于Yang等（2006）建立的轉化體檢測方法和農業部科技發展中心牽頭制定的國家標準，其原因可能是多對引物在反應體系中對模板產生競爭而導致檢測靈敏度有所下降。

本研究在綜合考慮擴增效率和簡化試驗優化步驟等前提下，選擇Master Mix PCR試劑，而未選擇DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+單獨包裝的PCR試劑。但從檢測方法實用性考慮，下一步可利用DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+單獨包裝的PCR試劑對檢測體系進行優化。

4 結論

本研究建立的抗除草劑轉基因油菜T45品系四重PCR檢測方法可實現在一個反應體系中同時檢測抗除草劑轉基因油菜T45內源參照基因和多個外源基因成分，有效簡化了操作步驟，縮短了檢測時間并提高了檢測效率，為轉基因油菜T45提供了一種有效的檢測手段。

參考文獻：

白月，才華，欒風俠，關學佳. 2011. 多重PCR結合DHPLC方法檢測番茄中轉基因成分[J]. 作物雜志，12（2）：28-31.

Bai Y，Cai H，Luan F X，Guan X J. 2011. Detection of genetically modified components in tomato by multiplex PCR and DHPLC[J]. Crops，12（2）：28-31.

崔學強，吳濤，李富榮，杜宗孝，樸文花. 2015. 多重PCR鑒定傷口中3種致病菌方法的建立[J]. 寧夏醫學雜志，37（4）：28-31.

Cui X Q，Wu T，Li F R，Du Z X，Piao W H. 2015. A study on identification of three pathogenic bacteria in wounds by using multiplex PCR method[J]. Ningxia Medical Journal，37（4）：28-31.

何瑋玲，張馳，楊靜，黃明，楊軍. 2012. 食品中 4 種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J]. 中國農業科學，45（9）：1873-1880.

He W L，Zhang C，Yang J，Huang M，Yang J. 2012. A quick multiplex PCR method for the identification of four meat ingredients in food products[J]. Scientia Agricultura Sinica，45（9）：1873-1880.

金蕪軍，賈士榮，彭于發. 2004. 不同國家和地區轉基因產品標識管理政策的比較[J]. 農業生物技術學報，12（1）：1-7.

Jin W J，Jia S R，Peng Y F. 2004. Comparison of labeling policy of genetically modified products in different countries and territories[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，12（1）：1-7.

聶淑晶. 2008. 轉基因油菜轉化事件特異性檢測技術[D]. 北京：中國農業科學院.

Nie S J. 2008. Event specific detection of transgenic rapeseed[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.

邵碧英，陳文炳. 2005. 玉米及其制品中轉基因成分的單一PCR及多重PCR檢測[J]. 食品科學，26（9）：380-385.

Shao B Y，Chen W B. 2005. Detection of genetically modified components in maize and its products by single PCR and multiplex PCR[J]. Food Science，26（9）：380-385.

申愛娟，陳松，周曉嬰，戚存扣. 2014. 轉基因油菜W-4 T-DNA 旁側序列分析與事件特異性檢測[J]. 江蘇農業學報，30（1）：10-20.

Shen A J，Chen S，Zhou X Y，Qi C K. 2014. Analysis of the flanking sequence and event-specific detection of transgenicline W-4 of Brassica napus[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science，30（1）：10-20.

尹全，宋君，劉勇. 2010. 生物技術作物食品檢測技術研究進展[J]. 江西農業學報，22（5）：135-137.

Yin Q，Song J，Liu Y. 2010. Research progress in detection techniques for food from biotech crops[J]. Acta Agriculture Jiangxi，22（5）：135-137.

張春嬌，許文濤，程國靈，趙維薇，戴蘊青，羅云波，黃昆侖. 2011. 轉基因玉米的多重PCR-毛細管電泳紫外檢測技術研究[J]. 食品工業科技，32（2）：328-332.

Zhang C J，Xu W T，Cheng G L，Zhao W W，Dai Y Q，Luo Y B，Huang K L. 2011. Study on genetically modified maize by multiplex polymerase chain reaction-capillary electrophoresis with UV detection[J]. Science and Technology of Food Industry，32（2）：328-332.

張富麗，雷紹榮，劉勇. 2009. 轉基因作物及加工品檢測技術概述[J]. 生物技術通訊，20（5）：733-737.

Zhang F L，Lei S R，Liu Y. 2009. Detection methods for transgenic crops and its processed goods[J]. Letters in Biotechnology，20（5）：733-737.

張麗，武玉花，吳剛，曹應龍，李均，盧長明. 2012. 轉基因油菜篩查檢測策略研究[J]. 中國油料作物學報，34（1）：74-81.

Zhang L，Wu Y H，Wu G，Cao Y L，Li J，Lu C M. 2012. Strategy of transgenic rapeseed screening based on exogenous gene elements[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，34（1）：74-81.

鄭景生，呂蓓. 2003. PCR技術及實用方法[J]. 分子植物育種，1（3）：381-394.

Zheng J S，Lü B. 2003. PCR technique and its practical methods[J]. Molecular Plant Breeding，1（3）：381-394.

中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局. 2004. GB/T 19495.6-2004：轉基因產品檢測 基因芯片檢測方法[S]. 北京：中國標準出版社.

General Administration of Quality Supervision，Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China. 2004. GB/T 19495.6-2004：Detection of Genetically Modified Organisms and Derived Products—Detection Method of Gene Chip[S]. Beijing：China Standard Publishing House.

中華人民共和國農業部. 2012a. 農業部1782號公告-3-2012：轉基因植物及其產品成分檢測 調控元件CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社.

The Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China. 2012a. The MOA Announcement No.1782-3-2012：Detection of Genetically Modified Plants and Derived Products—Qualitative PCR Methods for the Regulatory Elements CaMV 35S Promoter， FMV 35S Promoter， NOS Promoter， NOS Terminator and CaMV 35S Terminator[S]. Beijing：China Standard Publishing House.

中華人民共和國農業部. 2012b. 農業部1782號公告-6-2012：轉基因植物及其產品成分檢測 bar或pat基因定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社.

The Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China. 2012b. The MOA Announcement No.1782-6-2012：Detection of Genetically Modified Plants and Derived Products—Qualitative PCR Method of bar or pat Gene[S]. Beijing：China Standard Publishing House.

中華人民共和國農業部. 2013. 農業部2031號公告-9-2013：轉基因植物及其產品成分檢測 油菜內標準基因定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社.

The Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China. 2013. The MOA Announcement No. 2031-9-2013：Detection of Genetically Modified Plants and Derived Products—Target-taxon-specific Qualitative PCR Method for Rapeseed[S]. Beijing：China Standard Publishing House.

周穎，黎源倩，裴曉方. 2007. 轉基因玉米的多重PCR-毛細管電泳—激光誘導熒光檢測方法研究[J]. 高等學?；瘜W學報，28（8）：1458-1463.

Zhou Y，Li Y Q，Pei X F. 2007. Rapid and sensitive analysis of genetically modified maize by multiplex PCR and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[J]. Chemical Journal of Chinese Universities，28（8）：1458-1463.

Henegariu O，Heerema N A，Dlouhy S R，Vance G H. Vogt P H. 1997. Multiplex PCR：critical parameters and step-by-step protocol[J]. Biotechniques，23（3）：504-511.

Yang L T，Pan A H，Zhang H B，Guo J C，Yin C S，Zhang D B. 2006. Event-specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction analysis for genetically modified canola T45[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，54（26）：9735-9740.

（責任編輯 王 暉）