基于JAK2/STAT3信號通路探究調控miRNA-27a對肺結核大鼠的干預效果

吳海燕 林娟娟 戢晴 楊朝暉 徐紅艷

[摘要]?目的?分析基于蛋白酪氨酸激酶2（janus?kinase?2，JAK2）/信號轉導因子和轉錄激活因子3（signal?transducer?and?activator?of?transcription?3，STAT3）信號通路探究調控微RNA（microRNA，miRNA）-27a對肺結核大鼠的干預效果。方法?選取50只雄性SPF級Wistar大鼠，采用隨機數字表法選取10只大鼠作為對照組，另外40只建立肺結核模型，將建模成功的30只大鼠分為模型組（n=10）、沉默組（n=10）、過表達組（n=10）。對照組和模型組大鼠注射生理鹽水，沉默組大鼠尾靜脈注射10μl?miRNA-27a沉默慢病毒懸液，過表達組大鼠尾靜脈注射10μl?miRNA-27a過表達慢病毒懸液。比較miRNA-27a表達量、結核分枝桿菌菌落數、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）表達水平，以及JAK2、STAT3?mRNA、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達量水平。結果?與對照組相比，模型組miRNA-27a表達量降低，結核分枝桿菌菌落數、IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α、JAK2、STAT3?mRNA、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；
與沉默組相比，過表達組miRNA-27a表達量升高，結核分枝桿菌菌落數、IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α、JAK2、STAT3?mRNA、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論?上調miRNA-27a表達，可改善肺結核大鼠體內菌落水平，使大鼠肺損傷減輕，其機制可能抑制JAK2/STAT3信號通路相關。

[關鍵詞]?肺結核；
蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導因子和轉錄激活因子3；
微RNA-27a；
干預效果

[中圖分類號]?R521??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.14.002

To?explore?the?intervention?effect?of?regulating?miRNA-27a?on?pulmonary?tuberculosis?rats?based?on?JAK2/STAT3?signaling?pathway

WU?Haiyan1，?LIN?Juanjuan2，?JI?Qing3，?YANG?Chaohui1，?XU?Hongyan1

1.Department?of?Infection，?Taizhou?First?people"s?Hospital，?Taizhou?318020，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Emergency，?Taizhou?Hospital?of?Zhejiang?Province，?Taizhou?317000，?Zhejiang，?China;?3.Department?of?Nephrology，?Taizhou?First?Peoples?Hospital，?Taizhou?318020，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?analyze?the?effect?of?the?signal?transducer?and?activator?of?transcription?3?（STAT3）?signalling?pathway?based?on?janus?kinase?2?（JAK2）?on?the?regulation?of?microRNA?（miRNA）-27a?in?rats?with?pulmonary?tuberculosis.?Methods?A?total?of?50?male?SPF-grade?Wistar?rats?were?selected.?10?rats?were?selected?as?the?control?group?according?to?the?random?number?table?method，?and?the?other?40?were?used?to?establish?a?tuberculosis?model.?Totally?30?rats?were?successfully?modelled?and?divided?into?model?group?（n=10），?silent?group?（n=10）?and?overexpression?group?（n=10）.?The?rats?in?the?control?and?model?groups?were?injected?with?saline，?the?rats?in?the?silent?group?were?injected?with?10?μl?of?miRNA-27a?silencing?lentiviral?suspension?in?the?tail?vein，?and?the?rats?in?the?overexpression?group?were?injected?with?10?μl?of?miRNA-27a?overexpression?lentiviral?suspension?in?the?tail?vein.?Compared?miRNA-27a?expression，?mycobacterium?tuberculosis?colony?count，?interferon-γ?（IFN-γ），?interleukin-6?（IL-6），?cyclooxygenase-2?（COX-2），?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α）?expression?levels，?as?well?as?JAK2，?STAT3?mRNA，?JAK2，?p-JAK2，?STAT3，?p-STAT3?expression?levels.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?model?group?showed?decreased?miRNA-27a?expression?and?increased?expression?of?mycobacterium?tuberculosis?colony?number，?IFN-γ，?IL-6，?COX-2，?TNF-α，?JAK2，?STAT3?mRNA，?JAK2，?p-JAK2，?STAT3，?p-STAT3，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Compared?with?the?silent?group，?the?overexpression?group?showed?increased?expression?of?miRNA-27a，?IFN-γ，?IL-6，?COX-2，?TNF-α，?JAK2，?p-JAK2，?STAT3，?p-STAT3.?The?expression?of?miRNA-27a?was?increased?and?the?expression?of?Mycobacterium?tuberculosis?colony?number，?IFN-γ，?IL-6，?COX-2，?TNF-α，?JAK2，?STAT3?mRNA，?JAK2，?p-JAK2，?STAT3，?p-STAT3?was?decreased?in?the?overexpression?group?compared?with?the?silencing?group，?and?the?differences?were?all?statistically?significant?（P<0.05）.?Conclusion?Upregulation?of?miRNA-27a?expression?can?improve?colonization?levels?and?reduce?lung?injury?in?rats?with?pulmonary?tuberculosis?by?a?mechanism?that?may?be?related?to?inhibition?of?the?JAK2/STAT3?signaling?pathway.

[Key?words]?Pulmonary?tuberculosis;?Protein?tyrosine?kinase?2/signal?transducer?and?activator?of?transcription?3;?MicroRNA-27a;?Intervention?effect

肺結核是由結核桿菌感染引起的慢性傳染疾病，可導致患者免疫力減低、胸痛、咳嗽、四肢乏力，嚴重時可對其他器官造成損害，甚至威脅生命[1-2]。臨床主要采用藥物干預和化學治療，但易出現用藥不規律、治療方案不合理等問題，導致患者出現耐藥性，治療效果受到影響[3-4]。故尋找新的生物學靶點較為重要。miRNA-27a為非編碼單鏈RNA分子，可抑制脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥因子產生，減輕體內炎癥反應，減少細胞凋亡[5]。蛋白酪氨酸激酶2（janus?kinase?2，JAK2）/信號轉導因子和轉錄激活因子3（signal?transducer?and?activator?of?transcription?3，STAT3）可對炎癥反應進行調節，介導缺血再灌注后肺損傷的發生，抑制該通路的激活，可使大鼠肺組織炎癥減輕，保護其肺組織[6]。因此，本研究基于JAK2/STAT3信號通路探究調控miRNA-27a對肺結核大鼠的干預效果進行分析，以明確miRNA-27a與肺結核的關系。

1??材料與方法

1.1??動物

選取50只雄性SPF級Wistar大鼠，體質量200～230g，購于導科醫藥技術（廣東）有限公司［動物許可證號：SYXK（粵）2022-0273］。所有大鼠在相對濕度70%、室溫25oC籠子中進行喂養，對所用水、食物進行高溫高壓殺毒，適應性喂養7d，本研究通過臺州市第一人民醫院倫理委員會審批（倫理審批號：2022-KY017-02）。

1.2??方法

1.2.1??miRNA-27a慢病毒載體構建??通過GenBanK查找獲得LPL基因序列，構建miRNA-27a沉默、過表達轉染質粒，由上海生博生物醫藥科技有限公司設計并合成，并進行慢病毒滴度測定（病毒滴度為1×109TU/ml）。

1.2.2??分組與建模??選取10只大鼠作為對照組，另外40只按照沈凌筠等[7]研究中肺結核大鼠的建立方法構建模型，采用0.9%氯化鈉溶液制作結核分枝桿菌懸液，于斜面培養基進行接種，37℃下培養5周，制作濃度、質量為5mg/ml的菌懸液，將0.2ml菌懸液注射于大鼠尾靜脈，建立肺結核模型，對大鼠肺組織病理切片檢查，出現干酪樣壞死、液化灶即為建模成功。共有10只大鼠建模失敗。將建模成功的30只大鼠分為模型組（n=10）、沉默組（n=10）、過表達組（n=10），對照組大鼠給予尾靜脈注射0.2ml生理鹽水。

1.2.3??miRNA-27a轉染??沉默組大鼠尾靜脈注射10μl?miRNA-27a沉默慢病毒懸液，過表達組大鼠尾靜脈注射10μl?miRNA-27a過表達慢病毒懸液，10?g/d，1次/d，對照組、模型組大鼠注射同劑量生理鹽水，1次/d，連續注射5d。

1.3??觀察指標

1.3.1??一般情況及病理組織學觀察??于miRNA-27a轉染后至處死前，對各組大鼠活動、形態、納食、毛發光澤度等一般情況進行觀察。處死后取大鼠肺組織，固定于4%甲醛中，48h后取出，采用梯度乙醇進行處理，并進行石蠟包埋，制作4?m病理切片，采用光學顯微鏡觀察其肺組織變化。

1.3.2??miRNA-27a、JAK2、STAT3表達量檢測??取大鼠肺組織，放入液氮中研磨，使用Takara反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量法進行鑒定miRNA-27a、JAK2、STAT3表達量，采用Primer5.0軟件設計引物序列，反應體系：0.4μl上下游引物、1μlcDNA模板、20μl蒸餾水。反應條件：95℃?5min、95℃?15s、58℃?30s，70℃?34?s，共進行40個循環，采用2–DDCt方法計算出miRNA-27a、JAK2、STAT3的表達量。miRNA-27a上游、下游引物序列分別為5-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3、5-GCGGAA?CTTAGCCACTGTGA-3，JAK2上游、下游引物序列分別為5-GAGAATGGCGACTACAATC-3、5-GAA?CAGCACCTGCTAAACTG-3，STAT3上游、下游引物序列分別為5-ACCAGCAGTATAGCCGTTC-3、5-GCCACAATCCGGGCAATCT-3，內參GAPDH上游、下游引物序列分別為5-CCTGGCACCCAGC?ACAAT-3、5-GGGCCGGACTCGTCATAC-3。

1.3.3??結核分枝桿菌菌落數檢測??取大鼠肺組織，進行組織勻漿處理后，采用0.9%氯化鈉溶液制作菌懸液，后經硫酸消化，于斜面培養基進行接種，37℃下培養5周，后采用全自動菌落計數儀對菌落進行計數。

1.3.4??炎癥因子水平檢測??取各組大鼠冷凍血清，解凍后采用酶聯免疫吸附法檢測γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，?COX-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）水平，采用碳酸鹽緩沖液稀釋待測液，倒入孔中，4℃下過夜，后棄去，沖洗干凈，孔中加入1%牛血清白蛋白，37℃孵育60min，后棄去，沖洗干凈，稀釋抗血清，每孔加入0.1ml，37℃下進行輕微搖晃40min，后棄去，沖洗干凈，使用TMB進行顯色處理，后在450nm波長下檢測吸光度，查出IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表達水平。

1.3.5??JAK2/STAT3通路蛋白表達量??采用蛋白免疫印跡法檢測大鼠肺組織中的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量，取各組大鼠冷凍肺組織，冰上溶解25min，制作組織勻漿，進行離心處理，使用BCA試劑盒檢測蛋白含量，提取等量蛋白質，采用凝膠電泳進行分離蛋白質，加入一抗，4℃下孵育過夜，漂洗，每次15min，3次，加二抗，孵育2h，漂洗，每次15min，3次，以GAPDH為內參，定量分析蛋白表達情況。

1.4??統計學方法

采用SPSS?19.0統計學軟件對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??一般情況觀察

對照組大鼠皮毛順滑、反應靈敏、飲食正常、活動較多；
模型組大鼠皮毛干枯毛躁、存在脫毛現象、反應較為遲鈍、食欲缺乏、活動較少；
沉默組大鼠毛發枯黃雜亂、脫毛嚴重、反應遲鈍、食欲缺乏；
過表達組大鼠體毛光澤度增加、脫毛現象降低、食欲上升，活動增加。

2.2??病理學特征比較

對照組大鼠肺泡清晰可見，結構正常；
模型組大鼠，肺泡形態發生變化，炎癥細胞出現浸潤狀態；
沉默組大鼠肺組織結構受到嚴重破壞，肺泡變形，炎癥細胞浸潤明顯；
過表達組大鼠肺組織趨于正常，炎癥細胞浸潤改善，見圖1。

2.3??miRNA-27a相對表達量和結核分枝桿菌菌落數比較

與對照組相比，模型組miRNA-27a表達量降低，結核分枝桿菌菌落數升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；
與沉默組相比，過表達組miRNA-27a表達量升高，結核分枝桿菌菌落數降低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1、2。

2.4??炎癥因子水平及JAK2、STAT3?mRNA表達量比較

與對照組相比，模型組IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表達水平及JAK2、STAT3?mRNA表達量均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；
與沉默組相比，過表達組IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表達水平及JAK2、STAT3?mRNA表達量均降低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3、4。

2.5??JAK2/STAT3信號通路蛋白相對表達量比較

與對照組相比，模型組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；
與沉默組相比，過表達組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表5、6，圖1。

3??討論

肺結核為免疫性疾病，主要是由結核桿菌誘導而產生，可導致自噬異常、炎癥、免疫紊亂等，具有較高的傳染性[8-9]。臨床治療肺結核的藥物通常使用較長療程，且肝腎毒性較強，可使患者治療依從性受到影響，故尋找合適的方法較為重要[10-11]。研究顯示，miRNA-27a可控制細胞內結核桿菌的生存[12]。肺部巨噬細胞受到感染后，可使其凋亡加快，促進炎癥、氧化應激反應的發展，使患者肺部病理損傷加重[13-14]。本研究結果顯示，過表達組肺結核內miRNA-27a表達升高，可使大鼠體內結核分枝桿菌菌落數降低，炎癥損傷減輕。相關研究表明，結核桿菌在肺組織內擴散，可加重體內炎癥、氧化反應，在大鼠肺組織中，增生型結核結節較多，且肺組織具有明顯炎癥細胞浸潤，過表達miRNA-27a可使腎缺血再灌注、脊髓損傷中的炎癥反應減輕，減輕肺組織炎癥損傷[15-16]。本研究與其結果相符，表明過表達miRNA-27a，可降低結核分枝桿菌菌落數、減輕炎癥反應。

本研究結果顯示，上調miRNA-27a表達，JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3表達量降低，且炎癥因子水平得到改善，表明過表達miRNA-27a改善大鼠體內炎癥因子水平可能通過抑制JAK2/STAT3通路，促進抗結核的免疫反應，使肺結核的發展受到抑制。有研究顯示，上調miRNA-27a表達，可減輕機體內炎癥反應，降低IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表達，使肺組織損傷減輕。肺結核的發生可使體內發生過度炎癥反應、過氧化損傷，故對其炎癥反應進行控制，抑制體內氧化應激狀態為治療肺結核的有效措施[17]。JAK2/STAT3可介導炎癥反應的發生，對JAK2/STAT3通路進行抑制，可使p-JAK2、p-STAT3水平降低，減輕體內炎癥反應，使肺細胞凋亡降低，改善肺組織損傷[18-19]。以上研究與本研究結果一致，表明過表達miRNA-27a可抑制JAK2/STAT3信號通路，抑制肺結核的發展。

綜上所述，肺結核發生后結核桿菌菌落數升高，機體內炎癥因子水平上升，經過表達miRNA-27a干預后可改善上述情況，其機制可能與JAK2/STAT3信號通路被抑制有關。

[參考文獻][1] BOOM?W?H，?SCHAIBLE?U?E，?ACHKAR?J?M.?The?knowns?and?unknowns?of?latent?mycobacterium?tuberculosis?infection[J].?J?Clin?Invest，?2021，?131（3）：?13–22.

[13] 張愛平，?楊江華，?梁曼曼，?等.?231例結核分枝桿菌培養陽性肺結核患者的耐藥情況分析[J].?皖南醫學院學報，?2021，?40（3）：?229–232.