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嚴 香 趙 倩 陳信義 張雅月
(北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700)
原發免疫性血小板減少癥(Primary Immune Thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性疾病，發病機制尚未明確，目前認為ITP的發病是由于體液免疫和細胞免疫介導的血小板過度破壞，以及巨核細胞數量和質量異常，導致血小板清除增強和生成受損而導致血小板計數降低[1]?；谥嗅t基礎理論及辨證論治原則，脾臟能統攝血液在經脈之中而不逸出脈外，因此ITP病因病機與脾氣虧虛、脾不統血關系密切，從而確定“從脾論治”ITP基本原則[2-3]，以健脾益氣攝血為治法，擬定健脾益氣攝血方。在前期研究中，我團隊實驗表明健脾益氣攝血方在升高ITP患者及動物血小板數值、改善出血癥狀方面療效尚佳[4-5]，其效應機制可能與調控凝血過程有關[6-7]。止血生理過程包括血管內皮、血小板聚集黏附和凝血功能之間的復雜相互作用[8]。因此本研究從凝血角度出發，以出血程度、凝血酶原時間(Prothrombin Time,PT)、活化部分凝血活酶時間(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)、纖維蛋白原(Fibrinogen,FIB)為觀察指標，探討健脾益氣攝血方對ITP模型小鼠凝血功能的影響，為ITP的中醫藥治療提供依據。
1.1 材料
1.1.1 動物 豚鼠100只，雌雄各半，體質量250 g，許可證號：SCXK(陜)2012-001，購于陜西省興平市天瑞實驗動物養殖場，普通環境飼養，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%；
BALB/c小鼠260只，雌雄各半，體質量18～22 g，許可證號:SCXK(陜)2014-002，購于中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心，無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級動物實驗室飼養，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%。本研究經陜西省西安醫學院動物倫理委員會審批(倫理審批號：XYLS2019069)。
1.1.2 藥物 潑尼松(上海晶純生化科技股份有限公司，貨號：P116562)。實驗用中藥浸膏由西安星華藥物研究所按照中藥新藥藥學標準制備并提供，包括:非從脾論治浸膏(穿山龍、三七)。健脾益氣攝血浸膏(黃芪、黨參、茯苓、白術、阿膠、茜草、炙甘草)。
1.1.3 試劑與儀器 完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，美國，批號:SLBF2619V)，不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，美國，批號:SLBH7317V)，生理鹽水(雙鶴藥業，批號：Y201407154W)，乙醚(Merck,美國,批號：100930)；
CA-1500型全自動血液凝固分析儀(Sysmex，日本，型號：CA-1500型)，全波長酶標儀(賽默飛科技公司，美國，型號:Multiskan GO no.51119300)。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備 取160只BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，從小鼠心臟取全血，以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，分離血小板并洗滌，用生理鹽水稀釋。取已分離的血小板分別與等量完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑混合成油包水狀作抗原，以含完全福氏佐劑抗原于0周注射100只豚鼠足掌、背及皮下，至少4點；
以含不完全福氏佐劑抗原分別于1、2、4周按上述相同部位與點數注射。第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，560×g，離心10 min后取上清液，即得血小板糖蛋白血清(Glycoprotein-antiplatelet Serum,GP-APS)，并貯存于-20 ℃冰箱待用。將APS從-20 ℃中取出，置56 ℃水浴30 min，用等量BALB/c小鼠紅細胞吸附至少2次，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度APS備用[9]。從100只BALB/c小鼠尾靜脈取血，用全自動血液分析儀檢測血小板計數，并隨機分為正常組、模型組、潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組5組，每組20只。除正常組按100 μL/20 g生理鹽水腹腔注射外，實驗各組按100 μL/20 g劑量注射APS，1次/d至實驗結束。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算相應樣品濃度。依據病證結合模型辨識標準判定造模是否成功[10]。APS血清組OD值平均為0.300，空白孔OD值平均為0.163，相差約2倍(P<0.01)，造模成功。
1.2.2 給藥方法 造模成功后第8天，正常組、模型組小鼠給予生理鹽水0.1 mL/10 g體積灌胃，潑尼松組給予濃度為2 mg/mL潑尼松溶液0.1 mL/10 g灌胃，中藥組均按照0.1 mL/10 g體積灌胃給藥。
1.2.3 檢測指標與方法
1.2.3.1 出血程度分級 參照中華醫學會血液病分會2020年頒布的指南中出血評分標準，結合動物實驗特點，擬定出血程度分級標準并進行動態觀察[11]。出血程度分級標準：0級為無出血現象；
Ⅰ級為注射部位輕度出血，其他部位有散在出血點；
Ⅱ級為注射部位明顯出血，并見有其他部位瘀斑、瘀點；
Ⅲ級為注射部位嚴重出血，皮膚大量瘀斑、瘀點，或皮膚發黑或破潰。注意在觀察出血程度時，要以出血面積與出血點密集程度描述，并關注出血部位、出血開始時間、止血時間、出血色澤、形狀等。觀察時間點為第8天(用藥前)、第10天(用藥第2天)、第12天(用藥第4天)、第14天(用藥第6天)、第16天(用藥第8天)共5個時間點，從實驗各組中隨機選擇10只小鼠動態觀察出血程度變化情況。
1.2.3.2 全自動血液分析儀檢測凝血功能 實驗結束后，各組隨機選取6只小鼠尾靜脈取血。用全自動血液凝固分析儀檢測PT、APTT、FIB。
2.1 出血程度觀察 在注射APS后第3天ITP模型小鼠皮下可見密集的鮮紅出血點，如腹部、四肢、耳緣處，部分瘀斑融合成片，持續時間3～4 d。見圖1。
圖1 模型小鼠出血情況
2.2 出血程度比較 給藥前，與正常組比較，各組出血程度顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；
模型組、潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明注射GP-APS后各組小鼠均有相似程度的出血傾向，組間具有可比性。
藥物干預第2天，與正常組比較，模型組小鼠出血程度差異有統計學意義(P<0.05)；
模型組及潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。
藥物干預第4天，與正常組比較，模型組小鼠出血程度差異有統計學意義(P<0.05)；
與模型組比較，潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組小鼠出血程度開始降低，表現出向0級與1級趨勢，但組間差異無統計學意義(P>0.05)。
藥物干預第6天，各組出血程度比較，差異有統計學意義(P<0.05)；
與模型組比較，潑尼松組、健脾益氣攝血組出血程度明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；
與非從脾論治組比較，健脾益氣攝血組差異無統計學意義(P>0.05)。
藥物干預第8天，各組小鼠出血程度組間比較，差異有統計學意義(P<0.01)；
與模型組比較，潑尼松組、健脾益氣攝血組出血程度改善，差異有統計學意義(P<0.01)；
與非從脾論治組比較，健脾益氣攝血組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。
表1 各組小鼠不同時間點出血程度比較(n=10)
2.3 各組PT、APTT和FIB比較 與正常組比較，模型組小鼠PT、APTT顯著升高，FIB水平下降，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，潑尼松組與健脾益氣攝血組PT、APTT明顯下降，FIB上升，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，非從脾論治組PT、APTT下降，FIB上升，差異無統計學意義(P>0.05)。3)與潑尼松組比較，健脾益氣攝血組PT、APTT、FIB差異無統計學意義(P>0.05)。與非從脾論治組比較，健脾益氣攝血組PT、APTT表達明顯下降，FIB水平上升，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。
表2 各組小鼠PT、APTT和FIB比較
ITP是一種自身免疫性疾病，其特征是由于血小，清除增強和生成受損而導致血小板計數降低。ITP的臨床表現因患者而異，出血是最常見的表現，如皮膚、口腔、胃腸道出血或顱內出血等[12-13]。在中醫學中，ITP屬“血證”“虛勞”“紫斑”等范疇，現統一命名為“紫癜病”[14]。明代御醫薛立齋是最早提出“脾統血”思想的醫家，他指出：“心主血，肝藏血，亦能統攝于脾，補脾與胃，血自生矣?！盵15]“脾主統血”是指脾有統領與固攝血液在脈道中常態運行，不逸出脈外的生理功能，其內涵實質是“脾氣健旺，運化有?！?。反之即是“脾不統血”的病理現象，其發病機制是脾氣虛弱進一步加重或惡化的病理過程或結局，外在表象是“慢性出血”伴隨脾氣虛弱癥狀。中醫學中“血”是營養人體臟器組織，維持生命活動的紅色精微物質，而通過現代醫學手段觀測，血是指人或動物體內循環系統的不透明液體，主要包括血漿、血細胞、凝血因子等成分。團隊前期研究表明健脾益氣攝血方能夠改善ITP患者出血癥狀，提高血小板計數，調控血管活性因子[6-7]，提示上述血液成分可能是脾統血功能發揮的對象。因此擬定健脾益氣攝血方，驗證“從脾論治”ITP的基本治法。
方中黃芪性溫味甘，歸脾、肺經，功效健脾益氣固表，此外臨床所見患者多表現為身體下部出血，故亦取其益氣升提之長，為君藥。黨參、茯苓、白術3藥為臣，取四君子湯之意，加強組方健脾益氣之力。茜草味苦性寒，歸肝經，可祛瘀通經、涼血止血，阿膠味甘平，歸肺、肝、腎經，具有補血止血、滋陰潤燥的功效；
二者共為佐藥，既增加止血作用，又可防止君臣補益太過而致血脈瘀阻或血熱妄行，有攝血不留瘀、補血不動血之效。再加一味炙甘草為使藥，益氣和中、調和諸藥[16-17]。陽性對照方面，潑尼松作為治療ITP的一線用藥，具有抗炎、調節免疫的作用[18]；
非從脾論治組選用具有化瘀止血、活血通絡功效的穿山龍、三七[19-20]。本研究中除正常組外，各組小鼠造模后出現相似程度的出血，藥物干預第6天及第8天，與模型組比較，潑尼松組、健脾益氣攝血組出血程度明顯下降，提示潑尼松及健脾益氣攝血方具有一定優勢。
凝血過程是一種復雜的級聯反應[21]。血管內皮細胞受損后，表達并釋放組織因子(Tissue Factor,TF)，啟動外源性凝血途徑；
基底膠原暴露，激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)，啟動內源性凝血途徑。2種途徑激活后，凝血過程進入共同途徑，生成凝血酶。在凝血酶的作用下，纖維蛋白原形成穩定交聯的纖維蛋白，以完成凝血過程。在研究中選取能夠代表凝血功能的PT、APTT、FIB3個關鍵指標，其中，PT主要反映外源性凝血系統狀態；
APTT反映內源性凝血系統狀態；
FIB又稱凝血因子I(FI)，是凝血過程的中心蛋白質[22]。本研究中，模型組小鼠PT、APTT顯著升高，FIB水平下降，提示ITP模型小鼠可能存在凝血功能異常。經潑尼松及健脾益氣攝血方干預后，小鼠PT、APTT明顯下降，FIB上升，非從脾論治組無明顯差異，提示潑尼松及健脾益氣攝血方能改善ITP小鼠凝血功能，從脾論治ITP具有一定優勢。
綜上所述，健脾益氣攝血方能明顯改善ITP小鼠出血程度及凝血功能，充分說明“從脾論治的”有效性，提示凝血因子可能是脾主統血生理功能的物質基礎。但本研究樣本量較少，今后將通過擴大樣本量進行驗證；
另外目前只初步探索了健脾益氣攝血方對ITP模型小鼠凝血功能的影響，其具體調控機制有待進一步研究。
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