流式細胞術外周血白細胞分類方法的建立和性能評價

宋 穎， 韓姣姣， 趙 強， 徐 翀

（上海市臨床檢驗中心臨床血液體液學研究室，上海 200126）

外周血白細胞分類計數對感染和血液系統疾病的診斷和治療有重要意義。隨著臨床實驗室自動化程度的不斷提高，全自動五分類血液分析儀已成為主流儀器。在快速獲得白細胞分類結果的同時，儀器分類結果的可靠性驗證、分類結果室內質控失控后的處理、室間質評超出范圍后的原因分析等問題也日益顯現。

目前，各品牌血液分析儀配套校準品中均未包含白細胞分類計數參數，白細胞分類結果的可靠性一般是根據WS/T 246—2005《白細胞分類計數參考方法》[1]的要求進行評估，導致不同品牌，甚至同品牌不同型號的全自動血液分析儀白細胞分類結果可比性較差?，F有的白細胞分類計數參考方法基于操作人員顯微鏡下觀察染色血涂片的結果，具有很強的主觀性，存在操作人員技術水平差異較大、觀察區內細胞分布不均勻、觀察細胞數量有限、精密度差等諸多問題。流式細胞分析可大大提高分析細胞的數量，單克隆抗體的特異性結合也能提高對細胞的識別能力，建立基于流式細胞術原理的白細胞分類方法有重要的實際意義。本研究參照國際血液學標準化委員會（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）相關指南的建議[2]，采用流式細胞術進行外周血白細胞分類計數，并與全自動血液分析儀和顯微鏡鏡檢分類結果進行比較，以期建立一種可有效補充原有手工分類計數法的流式細胞術白細胞分類方法，進一步提高臨床血常規檢測中白細胞分類的準確性。

1.1 樣本來源

選取2021年8月—2022年3月上海市臨床檢驗中心健康體檢者50名，其中男23名、女27名，年齡24～58歲。排除有腫瘤、感染、自身免疫、心腦血管疾病等病史者。納入標準：血常規和肝功能、腎功能、血脂、血糖等常規生化項目檢測結果均在參考區間內。

1.2 儀器和試劑

日本Sysmex公司XN-20A1全自動血液分析儀及配套試劑、SP1000全自動推片染色儀。日本Olympus公司BX51光學顯微鏡。美國Cytek公司NL-CLC全光譜流式細胞儀；
美國BD公司熒光標記單克隆抗體[3]（CD16-Pacific Blue，克隆號為3G8；
CD45-V500，克隆號為HI30；
CD7-PE，克隆號為M-T701；
CD123-PerCP-Cy5.5，克隆號為7G3；
CD14-PECy7，克隆號為M5E2；
CD3-APC，克隆號為HIT3a；
CD19-APC，克隆號為HIB19；
CD11b-APC-Cy7，克隆號為ICRF44）；
美國賽默飛世爾公司SYTO 16 綠色熒光核酸染色劑（貨號S7578）。樣本檢測當日確保儀器室內質控在控。

1.3 方法

采集每位研究對象晨起空腹外周血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，3份分裝，分別采用3種方法檢測：（1）顯微鏡鏡檢（手工法），將樣本顛倒混勻后，用全自動推片染色儀制備成血涂片，并行瑞氏染色，由2位具備讀片能力的技師按照白細胞分類參考方法[1]分別進行200個白細胞分類鏡檢（合計400個白細胞），并記錄結果。（2）全自動血液分析儀檢測（儀器法），采用全自動血液分析儀進行全血細胞計數和白細胞分類[中性粒細胞（neutrophil，NEUT）、淋巴細胞（lymphocyte，LYMPH）、單核細胞（monocyte，MONO）、嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）、嗜堿性粒細胞（basophil，BASO）]計數。（3）全光譜流式細胞儀檢測（流式法），在絕對值計數管中分別加入樣本和單克隆抗體CD16-Pacific Blue、CD45-V500、CD7-PE、CD123-PerCPCy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3-APC、CD19-APC、CD11b-APC-Cy7、SYTO 16進行單克隆熒光染色，采用全光譜流式細胞儀進行檢測。

1.4 統計學方法

采用Medcalc軟件（version 20）進行數據分析。以手工法為參考方法，評價流式法和儀器法白細胞分類結果的準確性。采用Passing&Bablok回歸分析對3種方法白細胞分類結果進行兩兩比較，以回歸方程（Y=a+bX）和概率值（P）表示?；貧w方程通過概率值（P）、95%可信區間、斜率（b）和截距（a）、數據分布趨勢4個方面進行分析。概率值（P）≥0.05表示回歸線性模型與數據的匹配程度具有相關性，斜率b越接近1，截距a越接近0，表示2種方法白細胞分類結果相關性越好。

2.1 流式法和儀器法白細胞分類結果準確性

以手工法為參考方法，流式法中性粒細胞百分比（neutrophil percentage，NEUT%）、淋巴細胞百分比（lymphocyte percentage，LYMPH%）、單核細胞百分比（monocyte percentage，MO%）、嗜酸性粒細胞百分比（eosinophil percentage，EO%）、嗜堿性粒細胞百分比（basophil percentage，BASO%）項目分別有49、50、50、50、48例在95%可信區間內。儀器法NEUT%、LYMPH%、MO%、BASO%、EOS%分別有49、49、48、48、40例在95%可信區間內。按照99%的可信區間標準，流式法和儀器法所有白細胞分類比對結果均在參考區間內。

2.2 按流式法邏輯門判斷的白細胞分類結果

本研究流式法所采用的抗體組合類型為單克隆抗體，包括CD16-Pacific Blue、CD45-V500、SYTO16、CD7-PE、CD123-PerCP-Cy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3+CD19-APC、CD11b-APC-Cy7。ICSH指南[2]未列出邏輯門，本研究采用的設門邏輯見圖1，流式法不同分類白細胞與相應抗體的反應性見表1。

圖1 流式法白細胞分類的邏輯門設置

表1 不同分類白細胞對相應抗體（組合）的反應性

2.3 手工法、流式法、儀器法回歸分析結果

手工法與儀器法、手工法與流式法、儀器法與流式法NEUT%的回歸方程分別為Y=-1.13+0.99X（P=0.68）、Y=-0.96+0.98X（P=0.89）、Y=-1.53+1.01X（P=0.89），LYMPH%的回歸方程分別為Y=1.79+0.94X（P=0.89）、Y=2.64+0.94X（P=0.26）、Y=0.90+0.98X（P=0.89），MO%的回歸方程分別為Y=2.69+0.76X（P=0.42）、Y=2.74+0.68X（P=0.68）、Y=-0.11+0.97X（P=0.44），EO%的回歸方程分別為Y=0.25+0.93X（P=0.89）、Y=0.29+0.86X（P=0.44）、Y=0.01+1.00X（P=0.38），BASO%的回歸方程分別為Y=0.26+0.12X（P=0.44）、Y=0.30+0.50X（P=0.30）、Y=-0.23+2.33X（P=0.89）。NEUT%項目和LYMPH%項目的所有數據點均在95%可信區間范圍內，MO%項目和EO%項目有個別數據點落在95%可信區間外。儀器法與流式法的BASO%項目有個別數據點落在95%可信區間外。見圖2。

圖2 NEUT%、LYMPH%、MO%、EO%、BASO%項目手工法、流式法、儀器法兩兩回歸分析結果

從回歸方程的斜率和截距可見，按方法學進行比對，表現較佳的是儀器法與流式法的相關性。按項目進行比對，表現較佳的是NEUT%和LYMPH%；
儀器法與流式法EO%的回歸方程表現最佳；
BASO%項目3種方法兩兩比較的回歸方程表現欠佳。

從回歸方程的數據分布趨勢可見，MO%項目流式法與儀器法在細胞數量較低時的結果均高于手工法。MO%項目儀器法與流式法有很好的相關性。BASO%項目手工法與流式法、手工法與儀器法的數據離散程度較大，集中趨勢不明顯。BASO%項目流式法與儀器法數據分布呈比例，流式法的檢測結果約為儀器法的2倍。

目前，臨床血常規檢測中白細胞分類結果的參考方法仍然為手工法，此方法建立已有近20年的時間。由于手工分類的局限性，基于泊松分布的可信區間的比對已不適用于現有血液分析儀對分類結果的需求。由于血液分析儀的校準項目中不包含白細胞分類，實驗室在校準白細胞分類過程中常會遇到各種困難：（1）按手工分類參考方法的允許范圍判斷血液分析儀分類結果符合要求，且血細胞分類室內質控結果在控，無法解釋室間質評血液分析儀白細胞分類結果超出允許范圍；
（2）儀器工程師調整白細胞分類靈敏度系數沒有依據，無法驗證可靠性；
（3）實驗室內的多臺血液分析儀分類結果可比性差，無法確定靶機；
（4）血液分析儀提示異常細胞無法進行驗證，即血涂片中未發現異常細胞。

為了解決這些問題，近十年來，國內外多名專家[3-11]分別發表了基于不同配色方案的流式細胞儀白細胞分類計數法。隨著流式細胞儀硬件和技術的不斷進步，熒光檢測通道數量大大增加，且熒光素種類也更加豐富，不斷推動單管多色檢測的發展。ICSH指南[2]指出，要建立新的流式細胞術白細胞分類計數參考方法至少需要8色熒光或更多色抗體組合，才能從技術上滿足要求。

縱觀近十年的外周血白細胞分類流式法的進展，主要聚焦在6個方面：（1）采用的流式細胞儀機型更新換代；
（2）采用的熒光素由5色（FITC、PE、ECD、Cy5、Cy7）增加到10色（Pacific Blue、FITC、PE、PE-Texas Red、PCX、PE-Cy7、Alexa 594、APC、A700、APCCy7）；
（3）采用的抗體數量由6種（CD45、CD36、CD2、CRTH2、CD19、CD16）增加到29種（CD45、κ、λ、CD19、CD34、CD20、CD10、CD5、CD2、CD7、CD8、CD3、CD4、HLA-DR、CD15、CD33、CD117、CD13、CD38、CD71、CD64、CD14、CD16、CD123、CD36、DAPI、cκ、cλ、CD56）；
（4）樣本處理方式由多管溶血后洗滌法轉變為單管溶血免洗法；
（5）計數更加精確，由細胞相對百分比計數轉變為絕對值計數（絕對值計數管的使用）。

考慮到流式細胞儀的檢測能力和單克隆抗體熒光通道使用的數量，ICSH在2014年的指南[2]中列出了8色的配色方案（CD16-Pacific Blue、CD45 Krome Orange、SYTO16、CD7-PE、CD123-PerCP-Cy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3+CD19-APC、CD11b-APC-A750），但至今未見最終報告發表。本研究建立了基于此配色方案的實際應用方法，并進行初步驗證。從細胞分布看，各群細胞集中趨勢明顯，且均能被很好地區分；
采用CD45/SSC、CD3、CD19和CD7的抗體組合識別NK細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞，采用雙抗體結合的方式（CD16+和CD45+定義NEUT，CD123+和CD11b+定義BASO）識別部分LYMPH，提高了細胞識別的可靠性。

本研究還分析了不同方法白細胞分類計數結果，發現按照原有的手工法分類標準，流式法與血液分析儀法均符合要求，但無法滿足血液分析儀分類靈敏度調整的需求。原因可能為：（1）手工法的細胞分類數量遠遠少于其他2種方法，對于特征細胞群的檢出率低，如手工分類400個白細胞，BASO的檢出率仍可能為0；
（2）手工分類依靠檢測人員主觀識別，對于識別者技術要求高，某些形態變異的細胞不能被有效識別；
（3）質控品說明書所示部分細胞來源為動物替代細胞，通過細胞大小的空間布局來確認儀器分類性能的穩定性，而無法確認其準確性。儀器法和流式法的基礎均是流式細胞分析，僅是細胞鑒別的熒光素不同，血液分析儀采用熒光染液，流式細胞儀采用熒光素標記的單克隆抗體；
單克隆抗體具有很強特異性，通過多標記結合，能夠實現目的細胞群的精確識別，特別是對于外周血細胞中所占比例不高的細胞群體的識別（如BASO）優于傳統手工法。從本研究匯總數據的回歸方程看，3種方法NEUT、LYMPH分類結果具有可比性，儀器法與流式法的相關性優于另外2種組合。對于EOS的分類，儀器法與流式法結果高度一致。對于MONO的分類，流式法和儀器法在低值區域的識別率高于手工法。對于BASO的分類，流式法具有最佳的識別能力，可能與單克隆抗體的特異性識別有關。

本研究進行了單管8色流式法計數的探索，目的是提高外周血白細胞分類的準確性和精確性，為全自動血液分析儀白細胞分類提供技術保障。通過流式法對白細胞分類結果進行賦值，從而部分替代形態學方法驗證血液分析儀分類結果的可靠性。此種方法在比例較低的細胞群體的驗證方面具有較好的性能表現，如MONO、BASO可以通過流式特異性抗體結合的方法驗證血液分析儀分類的可靠性。研究流式細胞術白細胞分類法的最主要目的不是將其作為臨床實驗室的常規方法，而是幫助全血細胞分類計數儀的生產企業借助此參考方法在儀器研發、校準品和質控品的定值方面有所突破[2]，從儀器生產的源頭有效提高各儀器檢測結果的一致性。作為質量監管部門，可以通過流式細胞術這一新的白細胞分類計數方法對新鮮全血進行賦值，評估并監控臨床實驗室相關項目檢測結果的一致性。同時也可以在正確度驗證活動中對表現不佳的儀器進行技術改良或革新。

綜上所述，本研究建立的8色流式細胞術白細胞分類方法可同時適用于上游的生產廠家和下游的終端用戶（臨床實驗室），對快速、有效地提高白細胞分類計數結果的一致性具有重要意義。當然，如果臨床實驗室能夠投入人力、物力和技術建立這一流式細胞術白細胞分類方法，不僅可以日常監控全自動血液分析儀的工作性能，對血液胞分析儀報警樣本進行準確復核，還能及時對特征細胞群體作出初步確認。