VPAHPND毒力蛋白PirAB的原核表達與純化*

范賢平，張 晟，蔣 葛，曹曉慧，喬 毅，成 婕，徐軍田，胡闖顯，沈 輝**

(1.江蘇海洋大學海洋生命與水產學院，江蘇連云港 222000；
2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇南通 226007；
3.江蘇農墾金鯉漁業有限公司，江蘇鹽城 224500)

急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)是一種新出現的對蝦病害，可感染凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)、斑節對蝦(Penaeusmonodon)和中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)，死亡率為70%-100%[1]。據相關研究表明，AHPND病原為攜帶一個69 kD的pVA1質粒，可編碼pirA、pirB毒力基因的一類弧菌(VPAHPND)，通過基因重組和敲除技術，發現pirA和pirB的突變導致菌株致病力消失，證明PirA和PirB毒力蛋白是引起AHPND的主要致病因子[2]。Victorio-De Los Santos等[3]通過克隆重組PirA和PirB毒力蛋白，發現PirB亞基是一種特異性氨基糖凝集素，可與蝦肝胰腺上皮細胞膜上受體分子結合，從而觸發細胞大量脫落，這進一步證實了PirA、PirB毒力蛋白是AHPND的關鍵致病因子。

研究發現pirA和pirB毒力基因共同位于1 665 bp的基因片段上，pirA(336 bp)與pirB(1 317 bp)基因之間相隔12 bp基因序列，該序列分析結果與熒光發光桿菌(Photorhabdus)的pirA2B2[4]和致病桿菌屬(Xenorhabdus)的pirAB[5]基因相似，二者都利用自身的啟動子進行表達，重組表達產生的PirAB毒素對四齡棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)具有較強的殺蟲毒性[6]。Sirikharin等[7]將pirA和pirB基因片段分別克隆并連接到pET-17b載體和pGEX-4T-1載體，并在大腸桿菌(Escherichiacoli) BL-21(DE3)中表達，結果發現單獨表達pirA或pirB基因所得到的蛋白沒有毒性或毒性較低，猜測PirA和PirB重組蛋白需要結合才能誘發AHPND的典型癥狀。然而，誘導死亡所需的重組PirA和重組PirB組合的數量相對較高，其次表達載體、重組蛋白的構建方法和表達細胞系的選擇不同，可能導致重組蛋白的構象和活性發生變化，影響毒力大小[7-10]，最后PirA和PirB在致病機制中的作用尚未完全確定。本研究通過PCR擴增獲得VPAHPND的毒力基因，克隆并連接到pET 21b(+)原核表達載體上，并進行原核表達和純化，以獲取大量PirA、PirB及PirAB蛋白，為下一步的PirA/PirB毒力和抗體的研究積累技術基礎。

1.1 菌株和質粒

VPAHPND菌株(編號1669)和表達質粒pET 21b(+)由江蘇省海洋水產研究所生物技術室保存并提供，克隆菌株E.coliTop10、表達菌株E.coliBL-21(DE3)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試劑及儀器

高分子量蛋白marker、2×Taq PCR MasterMix、DNA分子量 marker、Nhel和Scal限制性內切酶、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒、Mag-Beads His-Tag蛋白純化磁珠、硝酸纖維素印跡膜(NC印跡膜)、10×TBST WB漂洗液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化(北京)科技有限公司；
兔抗(PirA和PirB)一抗、山羊抗兔IgG二抗(辣根過氧化物酶HRP標記)購自康為世紀生物科技有限公司，ClonExpressⅡ重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；
SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。蛋白電泳槽(DYCZ-24DN)、濕轉儀(DYCZ-4OD)購自北京六一生物科技有限公司；
冷凍離心機、PCR儀、移液槍均購自德國艾本德公司(Eppendorf)；
超微量分光光度計(DeNovix DS-11)購自廣州市深華生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的片段的擴增

將經平板純化的VPAHPND1669菌種轉接到LB液體培養基，28℃、200 r/min培養16 h，6 000 g離心收集菌體，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。根據GenBank登錄的pirAB基因(NC_025152.1)序列設計3對引物，分別用于擴增pirA、pirB、pirAB (表1)。下劃線分別為Nhel、Scal兩個酶切位點。pirA引物：pirA-F-Nhel/pirA-R-Scal，pirB引物：pirB-F-Nhel/pirB-R-Scal，pirAB 引物：pirAB-F-Nhel/pirAB-R-Scal。反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol/L)，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；
94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環；
最后72℃終延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化回收試劑盒純化并回收目的片段。

表1 PCR引物

1.3.2 重組表達質粒的構建

使用Nhel和Scal限制性內切酶酶切載體pET 21b(+)，酶切體系：ddH2O 11 μL，載體30 μL，10×QuickCut Buffer 5 μL，Nhel和Scal各2 μL；
酶切反應條件：37℃水浴2 h。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA回收試劑盒純化并回收目的片段。利用ClonExpressⅡ重組克隆試劑盒將pirA、pirB和pirAB的PCR擴增DNA片段連接到質粒載體pET 21b(+)，將連接產物轉化到感受態細胞Top10中，涂布于含有100 μg/mL 氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37℃過夜培養后，挑取單克隆進行Nhel和Scal雙酶切驗證，驗證正確的質粒送南京擎科生物科技有限公司測序。將鑒定正確的重組表達質粒轉入E.coliBL21 (DE3)中，涂布于LB平板(添加 100 μg/mL Amp)，37℃過夜培養，挑取單克隆菌落送南京擎科生物科技有限公司測序，進一步驗證連接的正確性及所克隆基因的完整性。

1.3.3 重組蛋白表達條件的優化

將鑒定正確的重組菌接種至含100 μg/mL Amp的LB液體培養基，37℃、200 r/min搖床培養過夜。為得到高濃度的重組蛋白，對誘導表達過程中的IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間進行優化。時間和溫度優化：在1.0 mmol/L IPTG濃度下，分別于20℃、25℃和30℃條件下，以150 r/min搖床培養4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h，各取2 mL菌液進行檢測。IPTG濃度優化：分別以0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L IPTG于20℃、150 r/min誘導16 h，各取2 mL菌液，離心棄上清。將菌體用0.01 mol/L PBS緩沖液重懸，冰浴超聲波破碎菌體，超聲條件：45 W、超聲5 s 停5 s,總時間5 min，超聲后4℃、10 000 r/min 離心10 min，分別取其上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導條件。

1.3.4 重組蛋白的純化與分析

按1∶100體積比接種過夜培養的重組菌液于500 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，160 r/min、37℃培養菌液至OD600為0.6-0.8；
以實驗確定的誘導時間、溫度、IPTG濃度誘導表達重組蛋白。誘導表達結束后，10 000 g離心10 min收取菌體，并用0.01 mol/L PBS重懸菌體進行超聲波破碎，10 000 g離心10 min收取上清液。按照Mag-Beads His-Tag蛋白純化磁珠說明書進行操作，使用含有不同濃度咪唑(5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、50 mmol/L、500 mmol/L)的洗脫緩沖液進行目標蛋白純化，并收集洗脫液。純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，并采用超微量分光光度計測定其蛋白質含量。

1.3.5 Western blot檢測重組蛋白表達

純化蛋白經12% SDS-PAGE分離，轉移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶于室溫封閉過夜；
用1×TBST WB漂洗液洗滌3次，每次5 min；
加入兔抗(PirA和PirB)一抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育2-3 h；
1×TBST WB漂洗液洗滌3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶4 000稀釋)，于室溫孵育1 h；
1×TBST漂洗液洗滌3次，每次10 min。最后用辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒底物顯色液顯色，觀察結果。

2.1 表達菌株的構建

pirA、pirB及pirAB擴增片段分別為336 bp、1 317 bp、1 665 bp，與預測目的條帶大小一致[圖1(a)]；
空載質粒pET 21b(+)雙酶切后全長為5 442 bp [圖1(b)]；
將目的片段和雙酶切后的pET 21b(+)質粒載體連接后，獲取重組質粒pET21b-pirA、pET 21b-pirB、pET21b-pirAB，經雙酶切驗證，條帶大小與預測一致[圖1(c)]。經測序結果分析，pirA、pirB和pirAB序列成功克隆至載體質粒中。

M:DNA marker,(a) Electrophoresis of PCR amplified fragments,(b) Double enzyme digestion of pET 21b(+) vector fragments,(c) Double enzyme digestion of recombinant plasmi

2.2 重組蛋白表達分析

2.2.1 IPTG濃度對誘導表達的影響

PirA (17 kDa)、PirB (50 kDa)及PirAB (50+17) kDa在8個濃度梯度組中均呈現清晰的目的條帶，表明8個濃度的 IPTG 都能誘導重組PirA、PirB和PirAB蛋白的表達，PirB和PirAB在不添加IPTG的情況下也能成功表達 (圖2)。重組蛋白PirB和PirAB在IPTG濃度為0時的表達量顯著低于IPTG濃度為0.01 mmol/L的表達量(圖3)，其他濃度的IPTG對重組蛋白表達量影響較小。因此，確定誘導重組蛋白PirA、PirB和PirAB表達的IPTG最適濃度為0.01 mmol/L。

M:Protein molecular weight standard;1-9:Supernatant of induced bacterial crushing solution (IPTG concentrations were 0 mmol/L,0.01 mmol/L,0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L,2.0 mmol/L,respectively);The target protein is shown in the frame

M:Protein molecular weight standard;1:IPTG concentration of 0.01 mmol/L;2:IPTG concentration of 0 mmol/L

2.2.2 誘導溫度和時間對誘導表達的影響

重組表達的溫度和誘導時間結果表明，隨著誘導時間的延長，重組蛋白PirA和PirAB表達量顯著上升，并于24 h達到峰值；
重組蛋白PirB的表達量在誘導4 h后沒有顯著變化(圖4)。重組蛋白在20℃、25℃和30℃條件下均能較好地表達，細菌裂解液的上清液和沉淀中都能觀察到目的條帶，根據目的條帶的粗細可知，80%左右的重組蛋白為可溶性表達(圖4)。如圖4：(j)-(l)所示，在20℃、25℃、30℃條件下，PirA和PirAB誘導24 h，PirB誘導4 h時，上清液樣品SDS-PAGE結果中30℃誘導培養時重組蛋白PirA、PirB和PirAB表達量最大。以上結果表明，30℃為PirA、PirB和PirAB重組蛋白的最適誘導溫度，重組蛋白PirA和PirAB的最適誘導時間為24 h，重組蛋白PirB的最適誘導時間為4 h。

M:Protein molecular weight standard;1:Broken liquid of uninduced bacteria;2-7:Supernatant of the disrupted liquid of induced bacteria (times are 4 h,8 h,12 h,16 h,18 h,24 h,respectively);8-13:Broken induced bacteria liquid precipitation (times are 4 h,8 h,12 h,16 h,18 h,24 h,respectively);The target protein is shown in the frame

2.3 重組蛋白純化及濃度測定

重組蛋白經純化后濃度為1.2-2.0 mg/mL，PirA、PirB重組蛋白經10 mmol/L咪唑洗脫后能得到高純度蛋白，PirAB經20 mmol/L、50 mmol/L、500 mmol/L咪唑洗脫液后均能得到高純度蛋白，獲得的3種高純度重組蛋白均可滿足多克隆抗體制備的要求(圖5)。

M:protein molecular weight standard;1:Unpurified crude protein;2,3:Wash miscellaneous liquid;4-8:Eluent (imidazole concentration is 5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L,50 mmol/L,500 mmol/L);The target protein is shown in the frame

2.4 Western blot檢測重組蛋白表達

Western blot 檢測結果顯示，PirA、PirB及PirAB分別在17 kDa、50 kDa及(50+17) kDa附近顯色(圖6)，與預測蛋白大小一致，表明所獲得的純化重組蛋白均具有較好的免疫原性。

M:protein molecular weight standard;1:PirAB;2:PirA;3:PirB

AHPND主要致病因子為毒力蛋白PirAB，大量獲取該蛋白的方式主要為硫酸銨沉淀法和異源表達。致病菌菌體中毒力蛋白PirAB表達量少，硫酸銨沉淀法獲得的毒力蛋白雜蛋白多，后期純化復雜，不利于后期的攻毒實驗。原核表達系統可以目標明確地獲得大量融合蛋白，通過親和層析純化，可有效降低雜蛋白含量，獲得高純度重組目的蛋白[11]。本研究直接將pirAB的全序列插入含有6個His標簽的pET 21b(+)載體中，然后將重組質粒轉入E.coliBL21(DE3)，并對重組菌種的表達條件進行優化，最后成功表達了PirA、PirB和PirAB重組蛋白。

誘導劑IPTG為乳糖類似物，不受細胞代謝的影響，但IPTG對E.coli生長亦存在抑制作用，因此，在不影響融合蛋白表達的基礎上應選用最小的劑量[12]。柴政斌等[13]發現，IPTG濃度對融合蛋白GST-PADI4的表達量無明顯影響，但可溶性目的蛋白的比例會隨著濃度的升高而增加。在本研究中，IPTG濃度為0時的PirB及PirAB表達量顯著低于濃度為0.01 mmol/L的表達量，其他濃度的IPTG對重組蛋白表達量影響較小。另外，相關研究表明，低溫誘導蛋白能促進蛋白的正確折疊，從而得到較好的可溶性蛋白，但合成的速率較慢[14]。本研究發現，PirA、PirB和PirAB重組蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，不易形成包涵體，盡管不同誘導溫度對各重組蛋白的表達影響較小，但在30℃條件下，重組蛋白的表達比例最高。這一結果與葉彩燕[15]誘導表達VPAHPNDPirB蛋白的誘導溫度一致。

PirAB與蘇云金芽孢桿菌 (Bacillusthuringiensis，Bt)殺蟲蛋白Cry具有較高的同源性，推測PirAB破壞宿主細胞的作用機制與Cry毒素較相似[16]。Lin等[17]的研究表明，在純化PirA和PirB單體的情況下，兩者相互結合的親合力較低，并提出了這兩種二元毒力復合物的異四聚體相互作用模型，認為PirA和PirB蛋白在重組的情況下形成的PirA/PirB復合體才會具有較強的細胞毒性，且PirA/PirB的結構也不穩定。pirA和pirB基因位于毒力質粒(pVA1)的同一個操縱子上[18]，理論上認為，這兩個基因在共表達情況下才產生PirA和PirB毒素，此時這兩者的相互作用才具有較高的細胞毒力[19]。Yang等[5]將嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) HB310 的pirA基因去除終止密碼子后，通過柔性連接子linker與pirB基因連接重組并融合表達了PirAB-fusion蛋白，同時共表達了PirAB蛋白；
經針對大蠟螟(Galleriamellonella)的半數致死量(LD50)驗證，共表達的PirAB蛋白生物活性比PirA/PirB重組蛋白混合物強，PirAB-fusion蛋白喪失了生物活性。在本研究中，在不去除PirA的終止密碼子的前提下，聯合表達pirA和pirB基因，得到的重組蛋白PirAB具有17 kDa的PirA蛋白和50 kDa的PirB蛋白，該聯合表達蛋白理論上具有較高的細胞毒性，可為后期抗體的研發提供技術資料。

綜上所述，本實驗在最適誘導條件和高效純化條件下獲得了小批量高純度的PirA、PirB重組蛋白，并首次共表達了VPAHPND的PirAB蛋白，SDS-PAGE電泳分析表明，表達的3種重組蛋白主要以可溶性形式存在，Western blot分析證實該重組蛋白質具有良好的反應原性。此實驗結果為下一步的抗體制備和致病機理研究提供了充足的實驗材料，為AHPND的防控研究提供了實踐基礎。