fMRI技術在犬科動物認知領域研究的應用

趙禹

(中國刑事警察學院警犬技術學院, 沈陽 110034)

動物認知學可以定義為研究動物思考和行為的過程及機制的一門科學[1]。家犬是第一個被人類馴化的物種[2],盡管起源進化問題一直以來在學術界存在爭議[3-5]。但由于其與人類社會生態的深度融合,近年來,已成為繼非人靈長類動物、嚙齒類動物、鴉科鳥類等動物之后,研究非人類物種行為認知特征的一種新的熱門模型動物。家犬被廣泛用于比較認知研究、認知進化理論解析及人類認知功能障礙性疾病自然模型動物研究等方向[6-10]。目前,家犬認知領域的研究除了通過設計能體現犬認知能力的各種實驗范式,觀察分析家犬在各實驗范式中的行為表現[11-12],研究其認知表型特征,已發展到使用腦電圖(EEG)、眼動追蹤(eye-tracking)、功能性磁共振成像(fMRI)等多種技術研究家犬行為認知特征深層次神經機制的研究[13-14]。其中,fMRI是一種新興的、非侵入式、安全、無創、能反映生物體大腦神經活動時空分布的神經影像學技術[15]。近年來,fMRI技術廣泛用于家犬(以下簡稱犬)認知神經機制的研究中。

功能性磁共振成像(fMRI)是一種無侵入、無創的主要用于對生物體大腦活動皮層區域進行準確定位的一種成像技術。20世紀90年代,Belliveau等[16]使用fMRI技術,應用灌注成像,采用視覺刺激范式,觀察到了人類視覺皮層區域的大腦活動影像。Ogawa等[17]開發的血氧水平依賴性成像(Blood Oxygenation Level Dependent,BOLD)的fMRI技術廣泛應用于大腦皮層功能定位。BOLD-fMRI也是目前應用最廣泛的腦功能成像技術。該技術應用的生理基礎是當大腦中某個特定區域的神經元被激活時,該腦區的神經元放電并耗氧,導致局部血氧水平短暫下降。接著含氧血液流向激活神經元所在區域,以滿足神經元的局部能量需求,使局部血氧水平很快增加,這種血液中的氧氣量超過了神經元活動所消耗的氧氣量,因此該區域的含氧血液過多會導致局部磁化率下降(因為氧合血紅蛋白是抗磁性的),導致磁共振信號強度增加。

fMRI技術廣泛應用于人腦功能及心理機制的研究?；趂MRI技術的人腦功能研究主要在任務態和靜息態兩種狀態下開展。任務態功能磁共振成像(task fMRI,tfMRI)是指受試者通過執行視覺、語言、思維、聽覺等特定的任務,根據特定腦區血氧含量的變化從而定位出該任務下大腦活躍區域的數據成像。靜息態功能磁共振成像(resting-state fMRI,RS-fMRI)是指在沒有明確任務的情況下,語言、注意力、聽覺、視覺等各功能腦區在靜息狀態下表現出的自發低頻波動數據成像。

MRI技術用于研究犬腦的解剖結構早于fMRI技術用于研究犬腦功能。對犬進行磁共振掃描分析前,一般要對犬進行麻醉,麻醉的目的是使犬在磁共振設備中保持靜止,而麻醉不會改變犬的大腦結構,因此獸醫領域中將MRI技術用于犬腦退行性疾病診斷、認知功能障礙等臨床疾病的診斷。由于麻醉的使用必然會改變犬的意識狀態、妨礙犬的注意力、并降低血流和呼吸速率。這可能導致參與認知加工的大腦區域的激活模式不被發掘。為了獲得正常狀態下的犬腦部功能成像數據,研究者們開始嘗試不使用麻醉,使用訓練有素的犬進行圖像采集。Tóth等[18]通過逐步訓練,使犬適應了磁共振儀器的環境和噪音,并在犬清醒、無約束靜止的狀態下,成功獲得了犬腦部磁共振成像的數據。但這項研究只包括了犬腦部的結構掃描。不久后,研究人員就獲得了犬清醒狀態下的腦部功能掃描成像。Berns等[19]首次發表了清醒和無約束狀態下家犬的fMRI數據采集。該小組研究人員通過正強化的方式訓練了兩頭犬在收集fMRI高質量成像圖像所需的時間內保持靜止,實驗中犬的頭部運動小于1 mm,無需藥物鎮定和身體綁定。研究人員采用視覺刺激范式,讓犬觀看之前形成條件反射的表示食物獎勵和無獎勵的兩種不同的手勢信號。通過fMRI成像,觀察到兩頭犬對有獎賞手勢信號反應的腦部尾狀核區域激活更明顯。目前為止,世界范圍內共有五個獨立的研究小組—兩個在美國(佐治亞州亞特蘭大市和奧爾本市)、兩個在歐洲(匈牙利布達佩斯市和奧地利維也納市)、一個在墨西哥(克雷塔羅),開展了清醒、無約束狀態下,通過視覺、嗅覺、聽覺等不同的實驗范式設計對犬腦部進行fMRI,定位不同實驗范式下犬腦部特定區域的激活狀態,進而確定犬的認知神經機制[20]。

2.1 基于視覺范式的認知研究

Berns等[19]在開發了一套讓犬在保持靜止、清醒和專注于認知任務的情況下進行fMRI的技術后,又在更多的樣本犬中實驗了該方法的可靠性。Berns等[21]在13頭受試犬中發現有8頭犬對獎勵的手勢信號在尾狀核有激活信號,驗證了fMRI技術在犬腦功能分析中結果的可靠性,可以在犬清醒的狀態下完成。Berns等[22]使用fMRI技術,通過觀察49頭訓練中的服務犬對熟悉訓導員和陌生人給出的表示獎勵或不獎勵的手勢信號腦部尾狀核、杏仁核和視覺皮層區域激活情況,結合犬的訓練結果,經過分析發現,成功的服務犬(不管是熟悉的訓導員還是陌生人給出的手勢信號)都產生了尾狀核激活,而杏仁體沒有過度激活,得出了使用fMRI技術可以預測犬經過訓練后能否成為一頭合格服務犬的結論。Dilks等[23]使用fMRI技術對6頭接受過在磁共振掃描儀中保持靜止訓練的犬進行了視覺面部識別能力研究。在犬的顳葉中發現了一個區域,該區域對人臉和犬臉的反應明顯高于對日常物體圖像的反應,而這種面部選擇性在犬的初級視覺皮層中沒有發現。該實驗證明了犬顳葉皮質中存在專門的面部選擇區域,揭示了專注于面部處理的神經機制并非靈長類動物獨有,可能有助于解釋犬對人類社會線索的高度敏感。Cook等[24]收集了犬在觀察它們主人喂另外一頭逼真的假犬模型時的fMRI腦部數據,研究了犬杏仁核激活與通過犬行為評估研究量表(Canine Behavioral Assessment and Research Questionnaire,C-BARQ)測試犬攻擊性氣質之間的關聯。C-BARQ測試結果顯示更具攻擊氣質的犬,在觀察到主人喂假犬時,表現出杏仁核區域更高的激活。這種機制可能與人類的嫉妒有一些相似之處。Cook等[24]還發現,當犬反復觀察到該情景時,杏仁核區域反應慣化,表明基于暴露的干預措施對潛在攻擊性犬的價值。

Gillette等[25]為了研究犬腦中真實世界和二維圖像視頻刺激是否具有等效性,向犬和人分別展示真實世界的人和物體以及相同人和物體的視頻,使用fMRI對犬和人進行掃描成像。在犬和人的腦部,發現顳后上溝(犬的外側裂)和枕外側復合體(犬的內外側回)對實時和視頻刺激都有顯著的激活區域。只有犬的外側裂區域對活體面部的激活程度明顯高于視頻面部,而在人類中,梭形面部區域和后顳上溝對活體面部的反應明顯高于視頻面部。證明了僅使用視頻刺激,也可以定位到犬腦部激活區域,盡管真實世界的刺激可能更突出。Karl等[14]為了研究犬與人的關系,向磁共振設備中保持靜止的犬分別展示其主人和陌生人的快樂或者憤怒表情的視頻。結果表明,犬主人快樂或憤怒的表情都激活了犬與人類依戀處理的有關大腦區域。相比之下,陌生人的視頻主要激活犬視覺和運動加工有關的大腦區域,而熟悉的人總體上激活相對較弱。大多數快樂的刺激會激活與獎賞處理相關的尾狀核,而憤怒的刺激會激活邊緣區域。結合眼動追蹤技術和行為偏好測試數據都支持照主人臉部的優勢角色,并且與fMRI實驗的結果一致。初步為犬與人類互動時假定的依戀系統的參與提供新穎和融合的見解。Cook等[26]為探究犬對與人社交和食物獎勵偏好的神經基礎,首先訓練15頭犬對3個不同的物品(玩具車、玩具馬和梳子)分別與口頭表揚、食物獎勵和對照(什么都沒有)建立聯系。3種物品任務下分別對清醒犬功能磁共振成像,比較腹側尾狀核的激活情況。結果表明,相對于對照刺激,尾狀核對獎賞預測刺激更為活躍。15頭犬中有13頭表現出贊揚獎勵與食物獎勵大致相當或更大的激活了尾狀核。尾狀核反應的個體差異表明,對一些犬來說,社會獎勵可能比食物獎勵更高,這可能有助于解釋社會互動在犬訓練中的明顯功效。

2.2 基于嗅覺范式的認知研究

嗅覺被認為是犬最強大、最重要的感覺。Berns等[27]使用嗅覺范式研究了犬對人類和同種動物的社會認知。經過訓練的犬在磁共振成像儀中保持靜止不動。分別對受試犬呈現5種氣味(自我、熟悉人、陌生人、熟悉犬、陌生犬),分析受試犬腦區的激活情況,重點分析犬腦尾狀核區域激活情況(因為該區域的激活與積極期望有關,而且該區域的解剖位置也很明確)。結果表明,犬腦嗅球部被五種氣味激活的程度相似,而尾狀核區域被熟悉人的氣味最大程度激活。犬尾狀核的激活表明,犬不僅能從其他氣味中分辨出熟悉人的氣味,而且與它有著積極的聯系。這說明了犬嗅覺的力量,并為人類在犬生活中的重要性提供了重要證據。Jia等[28]利用fMRI技術,通過比較清醒和麻醉狀態下犬大腦對不同氣味濃度的神經反應,研究犬嗅覺背后的認知過程。結果顯示,在出現高濃度和低濃度氣味時,清醒和麻醉狀態下犬的嗅球和雙側梨狀葉均表現出強烈激活。并且,激活強度及空間范圍由濃度介導,氣味濃度越高,激活強度越大。清醒狀態下的犬表現出內側、上、眶額葉皮質和小腦等區域的激活,所有這些區域都與認知過程有關,而麻醉犬的這些區域沒有激活,推測麻醉會降低氣味的處理,fMRI技術的應用可以更真實反映犬嗅覺系統活動的神經基礎。Prichard等[29]通過對18頭犬分別呈現與食物獎勵相關的目標氣味(a)、無關聯的分心氣味(b)以及兩種氣味的混合物(ab),獲得清醒犬各任務態下的fMRI數據,研究犬對a、b及混合氣味ab辨別的神經機制。研究人員獲得了每頭犬在3種氣味刺激呈現過程中腦部神經激活情況(主要關注3個已知的與氣味處理有關的區域,即尾狀核、杏仁核和嗅球)數據。研究者使用SPSS 24(IBM)中的混合模型程序分析發現3種氣味刺激在尾狀核、杏仁核和嗅球中都存在神經差異證據(P = 0.004),這3種氣味刺激因氣味類型而顯著不同(P < 0.001)。post-hoc檢驗對3個模型進行多次比較校正后,尾狀核和嗅球這兩個結果變得不顯著,只有杏仁核區域顯示出氣味刺激之間的顯著差異(P < 0.0001)。犬杏仁核區域激活情況最大限度地區分基于刺激-獎賞關系的氣味刺激(a),而混合物(ab)激活與無獎賞刺激(b)相似。Berns等[27]和Jia等[28]進行的研究為犬嗅覺神經成像的有效性提供了證據。嗅球一直與氣味的處理有關,麻醉的使用和氣味的強度與嗅覺的處理直接相關。此外,尾狀核的激活支持基于獎賞的氣味處理。而Prichard等[29]的結果顯示杏仁核區域的激活更能體現基于獎勵的氣味刺激。鑒于這些研究發現,有明確的證據表明,fMRI技術可用于探索犬的嗅覺加工。

2.3 基于聽覺范式的認知研究

聽覺在犬生活的許多方面起著重要作用,對于犬與人類和同類的溝通都非常重要。Bach等[30]使用簡單的高斯噪聲和規則的間隔聲(regular interval sounds,RIS)兩種聲音刺激模式,獲得了10頭麻醉比格犬聽覺刺激后的解剖圖像和功能掃描圖像。結果通過組分析,確定與右上橄欖核、外側丘系和內囊位置相匹配的顯著激活。此外,發現了聽覺皮層被大量激活的證據。RIS條件(包括基音)與高斯噪聲(無基音)的對比顯示,在與左側內側膝狀體核位置匹配的區域中有顯著影響。

Andics等[31]使用fMRI技術對犬和人的聲音敏感腦區的功能和位置進行了比較研究。11頭犬和22個人參與試驗,在掃描過程中呈現了一組相同的聽覺刺激,以尋找功能相似的聲音敏感皮層區域。證明犬的聲音區域存在,并且與人類前顳部的聲音區域表現出相似的模式。研究結果表明,在人和犬兩個物種中,都發現了大腦對聲音情緒效價線索的敏感性,定位在相似的非初級聽覺區域。犬的外側裂周圍區域和人的顳上溝和額葉下皮質均顯示出皮質聲敏感性。這兩個物種在內側膝狀體中均表現出敏感性。在犬的大腦中,確定了對犬的發聲以及人類的發聲和環境聲音最為活躍的亞區域。幾乎所有人類聽覺激活區域對人類發聲都是最大的,盡管內側膝狀體對犬的發聲表現出最大的激活。

Gábor等[32]結合犬的行為與fMRI數據,研究了犬與說話人的社會關系對犬腦語音處理區域的影響。發現犬對主人的行為依戀得分與犬聽到主人聲音引起的尾狀核神經活動增加程度正相關;次級聽覺尾側外側裂腦回的活動增加;聽到主人贊許后犬尾狀核活動增加。通過識別犬依賴于社會關系的神經獎賞反應,揭示了人類嬰兒與母親、犬與主人的依戀調節神經機制的相似性。

Cuaya等[33]使用fMRI研究了犬大腦的語音檢測和語言表征。使用多體素模式分析(MVPA)發現,雙側聽覺皮層區域代表自然語音和加擾語音的方式不同;在右聽覺區域,長頭犬的分類器性能更好。這種用于語音檢測的神經能力不是基于對語音的優先處理,而是基于對聲音自然度的敏感性。此外,在自然語言的情況下,兩種語言在次級聽覺皮層和皺褶前回都有不同的活動模式;年齡較大的犬對熟悉和不熟悉的語言的反應差異較大,表明語言接觸量的作用。在兩種語言的混亂版本中,沒有區域表現出不同,這表明自然語音中語言之間的活動差異反映了對語言特定規律的敏感性,而不是對光譜語音線索的敏感性。這些表明,不同的皮層區域支持犬大腦中的語音自然性檢測和語言表征。

犬認知神經機制的研究領域很廣,大部分研究者采用通過犬的視覺、嗅覺、聽覺等不同的實驗范式設計對清醒狀態的犬腦部進行fMRI,有的研究者根據自己的實驗目的在實驗中運用了不只一種感覺范式,有的還結合了犬的行為表型及其他一些實驗方法(如:腦電圖、眼動追蹤等)探索反映犬認知的神經機制。本文僅列舉了部分研究者的實驗成果,為國內開展家犬等動物認知領域研究提供思路參考。

在犬fMRI研究中,目前使用的fMRI硬件設備及腦影像數據采集、統計分析處理的方法標準都是為人類開發的。除了注意犬在磁共振儀中靜止的訓練方法、犬的安全性等問題外,尤其要重視提升犬fMRI方法參數上的改進,從而獲取各任務態下犬大腦更為真實、清晰、準確的成像信息,進而反映犬的認知本質。

3.1 犬運動問題

犬在各種實驗范式的任務態下保持靜止是fMRI應用的前提,運動狀態下的受試犬無法開展fMRI研究。Berns等[19]開發了正強化訓練法,首次獲得了清醒和無約束狀態下家犬的fMRI數據采集。目前為止,并非所有類型的犬都能開展此項研究,這是由犬的訓練性能決定的。研究人員認為理想受試犬的氣質特征是冷靜、具有好奇心、適應新環境快、不懼噪音、不恐高,在封閉環境中具有保持放松的能力,最重要的是在訓練期間表現出好的動機驅動力。盡管Berns等[19]、Jia等[28]、Andics等[31]訓練犬的方法略有不同,但都遵循經典的條件反射和操作式條件反射的原理。目前未見有訓練方法成功率比較的報道。任何訓練方法的首要目標都是減少訓練時間,同時保持所需的犬的某種行為。一般經過訓練后的犬在磁共振儀中保持靜止的時間至少4 min,保持靜止的時間與收集足夠數量的fMRI所需的時間相對應(實際持續時間取決于成像序列和實驗設計)。這期間,即使訓練有素的犬也會有搖頭、吞咽等影響fMRI數據的動作出現。數據分析中應特別強調進行數據處理(舍棄過度移動的圖片和去除微小運動產生的偽影)。例如,一些研究人員使用外置紅外攝像機跟蹤犬頭部運動的數據,對數據中的運動相關偽影進行回顧性校正[34]。

3.2 犬安全問題

由于磁共振環境中存在極高的聲壓級,工作時的聲級范圍在65 ~ 95 dB,峰值在120 ~ 131 dB,噪聲可引起犬的不適甚至短期聽力損傷[35]。在設計犬fMRI實驗時,Cook等[36]給犬佩戴消音耳罩來進行降噪處理,可以降噪高達28 dB。也有研究者采用或改變掃描參數,從而在掃描過程中衰減聲壓級[37]。除了噪聲水平外,犬的射頻比吸收率(SAR)也存在安全問題。盡管沒有針對非人類受試者的此類指南,但研究人員有責任在MRI實驗中使用犬來評估受試者經歷的SAR水平。犬在掃描設備內時,最好遵守FDA對人類的標準[20]。此外,將實驗犬放入MR環境之前必須確保犬體內沒有任何鐵磁性材料,體內存在導電材料可能會致過熱和燒傷。

3.3 硬件設備及軟件參數

犬的大腦與人類的大腦神經解剖學差異明顯,腦容積較人類小,血管和神經元生理等許多方面存在差異[38-40]。Huber等[41]建議為犬開發專門定制的fMRI硬件和數據分析方法,以獲得犬腦部更清晰的功能圖像,提高犬fMRI的敏感性和特異性。

3.3.1 線圈選擇

犬fMRI的圖像質量比人類fMRI圖像質量要低。主要是因為犬進行fMRI的射頻線圈和成像協議未按照犬的神經解剖學特點定制。犬的大腦最大為人腦的三分之一,大腦區域與人類大腦區域有很大的生理差異。已發表的犬類fMRI研究使用的都是不同類型的人類MRI線圈。線圈的幾何形狀沒有針對犬的頭部進行優化,靠近犬大腦的射頻通道數量有限。由于通道數量較少,與人類功能磁共振成像相比,時間和空間分辨率的預期成像性能都很低。專門為特定物種定制的線圈(如絨猴)fMRI成像質量已顯出巨大的優勢[41]。

3.3.2 場強參數選擇

Martín-Vaquero等[42]用麻醉犬分析3T和7T掃描儀兩種場強之間圖像質量的差異。結果表明,犬腦部的圖像在3T和7T場強的掃描儀中質量相當,由磁化率和化學位移引起的噪聲在7T掃描儀中更加明顯,建議使用3T掃描儀。這與預期的場強增加會提升圖像的空間分辨率和對比度分辨率結果相反。與3T不同,從7T獲得高質量的功能磁共振成像數據需要選擇適當的序列參數(隨場強變化)和使用高階填隙。因此,如果做得好,像7T這樣的高場強有可能提供更高的信噪比和更小的體素,這在犬類成像中至關重要,因為犬類的大腦結構相對小于人類。Jacqmot等[43]比較了1.5T、3T和7T場強下犬腦部T2加權圖像。結果也顯示7T超高場圖像在不同磁性組織之間的界面容易出現偽影,3T MR成像在評估犬腦解剖成像綜合效果較好,成像偽影較少。

3.3.3 血流動力學響應函數(HRF)

要探究fMRI數據與神經活動的關系,研究HRF模型是關鍵。由于不同物種大腦大小、形狀及血管和神經元生理特征存在差異,不同物種的HRF有所不同。例如,在清醒的嚙齒動物中,HRF峰值的潛伏期為2 s,而人類使用的標準HRF的峰值潛伏期為6 s[34]。以往犬的功能磁共振成像研究通常使用人類的HRF。Boch等[44]揭示了犬在視覺刺激范式下,HRF峰值比人類更早出現,并表明使用定制的犬的HRF對提高犬fMRI檢測能力具有重要作用。

3.4 實驗的嚴謹性

鑒于犬fMRI是一個新興領域,實驗嚴謹性還有很多需要不斷完善的方面。如:犬沒有主觀性,缺乏任務刺激傳遞給犬的時間控制,這在BOLD信號的一般線性建模中是一種缺陷[19];關于犬fMRI研究的樣本量普遍較小,而由于犬的品種、性別及個體的認知差異,可能導致結果分析存在偏差[41];缺乏公認的高質量的犬大腦皮層圖譜限制了研究人員對犬腦功能機制的精準研究。最近已有研究人員開展犬大腦皮質圖譜的研究制定,以便為今后開展犬腦功能研究的精準區域定位使用[45-46]。

使用fMRI技術開展犬在清醒、無約束、靜止狀態下的認知機制研究,除了有從事犬認知研究的研究人員,還需要專業訓練犬在磁共振儀中保持靜止的訓練團隊和磁共振操作分析團隊通力合作。隨著fMRI技術在犬認知領域研究工作的不斷應用,越來越多的關于犬認知的神經機制被揭秘。這不僅使人類更了解犬,而且在比較認知研究和解析認知進化理論中都取得了不少的成果,也為人類開展認知功能障礙性疾病研究提供了一種新的模型動物。此外,fMRI技術應用于犬認知領域研究,還可以提高工作犬的選育進程。以往我國工作犬(如:軍警犬、導盲犬等)的選擇都在犬的行為水平開展。而工作犬能否勝任工作,除了外在的行為表型,內在的認知能力(如:執行能力、工作記憶、社會認知等)至關重要[47-48]。開展工作犬認知水平的研究是工作犬選育的一個新的領域和方向。通過設計科學的任務實驗范式,用fMRI研究那些經過嚴格訓練并在工作中取得成功的工作犬的腦部激活區域特征模式,從而更好的識別工作犬的認知特征標準。