水稻瘤矮病毒介導的轉cry1Ab水稻對褐飛虱種群的影響

苗 鑫，劉煜曉，陳文樂，郭齊湯，尤士駿，林 勝*

（1.福建農林大學植物保護學院/閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室，福州 350002；
2.福建農林大學海峽兩岸特色作物安全生產省部共建協同創新中心，福州 350002；
3.三明市植保植檢站，三明 365000；
4.三明市煙草公司大田分公司，三明 366100；
5.福建省農產品安全研究平臺，福州 350002；
6.害蟲綠色防控福建省高校重點實驗室，福州 350002）

水稻是全球范圍內種植最為廣泛的作物之一，世界上有超過一半的人口以大米作為主食[1]。我國種植水稻的歷史至今已有7000余年[2]，且水稻的種植面積占比很大[3]。事實上，影響水稻產量的因素有很多，但蟲害是影響水稻產量及稻米品質的一大要素[4]。中國稻區數目眾多的害蟲會對不同生長階段的水稻不同部位造成為害。由于這些水稻害蟲每年帶來很大的損失，因此研究可應用于實際生產的轉基因抗蟲水稻格外重要[5]。

褐飛虱Nilaparvata lugens(St?l) 是水稻作物上的一種典型的主要害蟲，它是遷飛性的刺吸式昆蟲，主要以刺吸水稻的韌皮部汁液為食，它也是水稻病毒病的傳播載體，會對水稻植株產生嚴重為害[6,7]。Zhang等[8]研究發現，在水稻抗性品種中，褐飛虱若蟲的存活率明顯降低，若蟲發育通常被延遲，產卵受到嚴重抑制，并且種群生長得到有效抑制。近年來許多學者開展了轉基因水稻對非靶標害蟲抗性問題的研究，劉雨芳等[9]通過田間試驗發現轉基因抗蟲水稻Orseoia oryzae(Wood-Mason) 產生抗性。Akhtar等[10]研究發現轉Bt抗蟲水稻對稻薊馬Stenchaetothrips biformis(Bagnall) 的生長發育和繁殖會造成明顯的負面影響；
王文晶等[11]經過大田試驗發現轉 Bt水稻與親本非轉基因水稻相比，稻田褐飛虱和白背飛虱Sogatella furcifera(Horváth) 的種群發生量明顯提高；
周霞等[12]在研究轉 Bt水稻克螟稻對黑尾葉蟬Nephotettix cincticeps(Uhler) 種群增長的影響時發現，黑尾葉蟬在轉Bt水稻與非轉基因對照水稻上的雌成蟲壽命、產卵量、產卵持續時間以及凈生殖率均明顯高于親本對照。

同時，由水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）引發的水稻瘤矮病近幾年在我國南方多省水稻產區發生流行，如福建、廣東、海南省等，這一重要病害對水稻產量有一定的影響，但目前并無有效的防治方法[13]。作為一種持久增殖并且是循回型的病毒，RGDV可以有效地傳播擴散到電光葉蟬Recilia dorsalis(Motshulsky) 等介體昆蟲體內，從而達到系統侵染[14,15]。目前已有學者開始關注病毒-轉基因水稻-非介體昆蟲的互作關系，何曉嬋等[16]研究表明，在感染病毒水稻植株上取食對白背飛虱若蟲存活率、發育歷期、成蟲性比、雌成蟲體質量、產卵量和卵孵化率等影響不顯著，但雌成蟲壽命和卵歷期顯著縮短；
Xu等[17]研究發現不同水稻品系和感染、未感染南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）的水稻植株對褐飛虱的性別比例、雌成蟲體質量、壽命、繁殖力和卵孵化率均無顯著影響，感染SRBSDV的轉Bt水稻對褐飛虱的生態適應性影響不大。那么，感染水稻瘤矮病毒的轉基因水稻是否會影響非靶標害蟲褐飛虱種群的發展？

因此，本試驗在人工氣候室條件下，利用年齡-齡期兩性生命表研究水稻瘤矮病毒介導的轉基因抗蟲水稻對非靶標害蟲褐飛虱種群的影響，研究結果有利于進一步明確轉基因抗蟲水稻的潛在生態風險，為推進轉基因抗蟲水稻的產業化提供科學依據。

1.1 試驗材料

1.1.1 供試水稻 抗蟲轉cry1Ab水稻（MF86）及其親本對照非轉基因水稻（MH3301）。由福建省農業科學院遺傳工程重點實驗室提供。

1.1.2 供試昆蟲 褐飛虱為福建農林大學應用生態研究所長期飼養在水稻TN1的品系。帶毒和不帶毒電光葉蟬為福建農林大學病毒所提供，所帶病毒為水稻瘤矮病毒，用PCR檢測其帶毒情況，后在福建農林大學應用生態研究所人工氣候室飼養，電光葉蟬飼養在2～3 cm的水稻幼苗上（MH3301），每隔8 d將電光葉蟬轉移至新鮮的水稻幼苗上，確保其獲取充足的營養。褐飛虱和電光葉蟬飼養條件：田間人工氣候室溫度為（28±1）℃，相對濕度（70%±1）%，光周期14L∶10D。

1.2 水稻培養及病毒接種

播種前將水稻種子放于室溫條件下浸種24 h，室溫催芽48 h待種子露白后進行旱育秧。每個塑料容器都裝入適量的土壤，搖晃使其平整后將露白的種子放入，胚芽均保持向上，然后覆蓋一層薄薄的土壤，放在人工氣候箱中生長（溫度：28 ℃±1 ℃，RH：70%±1%，光周期14L∶10D）。10 d后取旱育秧長勢相當的秧苗，移栽至30 mm×200 mm的玻璃試管中，試管中盛有pH已調至4.5～5的kimura B水稻營養液[18]，每管放入2株稻苗，然后在每個試管內放入已在RGDV病株上累代飼養的電光葉蟬3～4齡若蟲10頭，試管頂端用絲襪罩住并用橡皮筋綁好固定，放入人工氣候室內，待48 h后，除去蟲源。除蟲后在相同的條件下繼續培養，每周更換新的營養液。10 d后從單株植物中提取少量葉組織進行RGDV檢測，陽性植株作為帶毒組進行后續試驗。不感病的水稻處理用不帶毒的電光葉蟬取食水稻，處理同上。

1.3 構建年齡-齡期兩性生命表

從實驗室取褐飛虱成蟲分別放置在未感病水稻MH3301，MF86以及感病水稻MH3301，MF86中，產卵24 h后取出水稻，單獨養殖于養蟲籠中，每天觀察水稻及褐飛虱情況，直至觀察到有1齡若蟲出現，將其挑選到對應的水稻品種上，單蟲單苗單管飼養，并對試管進行編號。每個處理80頭褐飛虱，水培液每3 d更換一次，每天定時觀察和記錄褐飛虱的蛻皮、羽化、死亡等情況，并將蛻皮挑出。當其羽化為成蟲時，將褐飛虱雌、雄成蟲兩兩配對，飼養于相對應的水稻品種上，每天在顯微鏡下觀察記錄產卵量并更換新水稻苗，直到雌蟲死亡。為保證所有成蟲均能配對，將對應水稻在同一條件下另飼養幾十頭褐飛虱作備用種群，在構建生命表時，若為雌成蟲與備用雄成蟲配對的記錄其產卵量與壽命；
若為雄成蟲與備用雌成蟲配對的只記錄壽命。整個試驗在所有褐飛虱成蟲全部死亡時結束。

1.4 種群生命表數據的分析與處理

統計卵、若蟲、成蟲的發育歷期，以及產卵前期、產卵期、產卵后期、日繁殖率、最大繁殖率、達最大繁殖率時的成蟲年齡和總繁殖力等生殖相關參數[19]；
種群生命表參數包括特定年齡-齡期存活率（Sxj，表示種群中個體能存活到年齡x到齡期j的概率）、種群特定年齡存活率（lx，表示Sxj曲線在不考慮齡期分化情況下的簡化形式）、種群年齡繁殖率（mx，表示種群在年齡x時的平均產卵量）、雌成蟲年齡-齡期繁殖率（fxj，表示一頭雌成蟲在年齡x和齡期j所產的能夠孵化的卵粒數）、種群年齡凈增殖率（lxmx）、種群壽命期望（exj，表示個體存活到年齡x和齡期j的概率，其計算方法是假設s"iy＝1）、種群生殖價值（Vxj，表示在年齡x和齡期j對未來種群的貢獻）、種群世代凈增殖率（R0，表示種群在一定條件下經過一個世代后的每個存活個體所產生的后代總數）、種群穩定年齡增長結構（SASD，表示種群在食物、空間不受任何限制以及無天敵干擾的理想條件下，后代的齡期分布比例）、內稟增長率（r，表示種群的最大瞬時增長率）、周限增長率（λ，表示種群內平均每一個個體能產生的后代數）、平均世代周期（T，表示在穩定的齡期階段分布中，種群增長到其規模的R0倍所需要的時間長度）[20,21]。

采用單因素方差分析褐飛虱發育歷期、生殖相關參數和種群生命表參數在不同處理間的差異，并采用LSD進行多重比較。采用年齡-齡期兩性生命表分析軟件TWOSEX-MSChart中的Timing-MSChart 預測以100粒褐飛虱有效卵為起始的100 d種群動態[22]，由于TWOSEX-MSChart分析描述了種群生長過程中的階段變化，因此我們使用自然對數預測了齡期j從t到t＋1時間段的增長率?？紤]到在某一階段個體數為0（nj,t＝0或nj,t+1＝0）時不可能使用對數變換，因此我們在計算過程中使用nj,t+1和nj,t+1+1。

種群動態參數相關的計算公式如下：

運用SigmaPlot 12.0軟件制作褐飛虱發育歷期、存活率、壽命期望、生殖價值和種群預測等的曲線圖。

2.1 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱種群動態參數的影響

感病的MF86較未感病的MF86顯著降低褐飛虱的內稟增長率、周限增長率和凈增殖率，顯著縮短世代平均周期；
感病的MH3301較未感病的MH3301對褐飛虱生命表動態參數的影響均不顯著。水稻在不感病的情況下，取食MF86較MH3301顯著提高了褐飛虱的內稟增長率、周限增長率和凈增殖率，并顯著延長了褐飛虱的世代平均周期。水稻在感病的情況下，MF86較MH3301顯著降低了褐飛虱的內稟增長率、周限增長率和凈增殖率（表1）。

表1 褐飛虱種群動態參數Table 1 Population dynamic parameters of BPH

2.2 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱種群生殖相關參數的影響

水稻在感病的情況下，取食MH3301的褐飛虱種群顯著縮短了產卵前期和產卵期，取食MF86的褐飛虱種群顯著縮短了雌成蟲壽命、雄成蟲壽命、產卵期以及繁殖力；
水稻在不感病的情況下，除4齡若蟲外，取食MF86的褐飛虱較取食MH3301的種群參數均顯著延長，而水稻在感病情況下，取食MF86較取食MH3301的褐飛虱雄成蟲壽命、日繁殖率、最大繁殖率以及總繁殖率顯著縮短。感病與否對取食MH3301及MF86的褐飛虱壽命均影響不顯著，而感病的MH3301較未感病的MH3301顯著提高了褐飛虱的生殖力。感病的MF86較未感病的MF86顯著降低了褐飛虱的生殖力（表2，表3）。

表2 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱發育歷期的影響Table 2 Effect of RGDV-infected transgenic cry1Ab rice on the developmental duration of BPH

表3 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱生殖相關參數的影響Table 3 Effect of RGDV-infected transgenic cry1Ab rice on the reproductive parameters of BPH

2.3 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱種群年齡-齡期存活率的影響

取食感病和未感病MH3301的褐飛虱成蟲前期的存活率曲線基本相似，取食未感病的成蟲期的存活率明顯高于取食感病的；
取食感病和未感病 MF86的褐飛虱存活率曲線基本相似，取食未感病水稻的 4、5齡若蟲和雌、雄成蟲的存活率均略高于取食感病水稻的。水稻在不感病的情況下，取食 MH3301較取食MF86的褐飛虱種群存活率升高，取食MH3301的褐飛虱成蟲期存活率可達到0.3，而取食MF86的褐飛虱成蟲期存活率最高僅0.15左右。水稻在感病的情況下，取食MH3301較取食MF86的1、2齡若蟲存活率略低；
取食MH3301較取食MF86的3～5齡若蟲和成蟲期的存活率均較高，其中取食MH3301的褐飛虱4、5齡若蟲存活率可超過0.5，而取食MF86的褐飛虱4、5齡若蟲存活率最高僅可達到0.25左右（圖1）。

圖1 褐飛虱年齡-齡期存活率曲線圖Fig.1 Age-stage survival curve of BPH

2.4 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱生殖力的影響

褐飛虱的年齡特征存活率lx隨時間逐漸降低。取食感病水稻的年齡特征存活率lx較取食未感病水稻的下降速度更快。水稻在不感病的情況下，隨褐飛虱年齡的增加取食MF86的年齡特征存活率lx較取食MH3301的下降速度減緩，其中取食MH3301的褐飛虱lx下降50%大約需要26 d，取食MF86的褐飛虱lx下降50%大約需要15 d。水稻在感病的情況下，兩個品系的年齡特征存活率lx曲線相似，lx下降速度均不斷減緩，隨褐飛虱年齡的增加取食MF86的褐飛虱的lx較取食MH3301的下降速度更快。fx、mx都隨褐飛虱年齡的增加先升高后下降，存在一定的波動性。水稻在不感病的情況下，取食MH3301較取食MF86的褐飛虱最大生殖力減??；
而水稻在感病的情況下，取食MH3301較取食MF86的褐飛虱最大生殖力升高。種群年齡特征生殖值lxmx則表現為：取食MH3301較取食MF86的褐飛虱lxmx明顯更高，但褐飛虱在MH3301的lxmx存在明顯波動而在MF86的lxmx較為平穩（圖2）。

圖2 褐飛虱存活率（lx）、年齡-齡期繁殖力（fxj）、種群年齡繁殖力（mx）和種群年齡特征生殖值（lxmx）Fig.2 Survival rate (lx), stage specific fecundity (fxj), age-specific fecundity (mx) and age-spefic matemity (lxmx) of BPH

2.5 感染水稻瘤矮病毒的轉cry1Ab水稻對褐飛虱壽命期望和生殖價值的影響

隨著褐飛虱年齡的增加，各個品系的壽命期望均呈現逐漸下降的趨勢。取食未感病水稻的褐飛虱壽命期望曲線與取食感病水稻的基本相似；
取食MH3301的褐飛虱1齡若蟲的壽命期望值基本保持在26 d左右，而取食MF86的褐飛虱1齡若蟲的壽命期望值更低，約為20 d左右。水稻在不感病的情況下，褐飛虱在MH3301的各若蟲齡期的壽命期望值均略高于在MF86的；
褐飛虱在MH3301的雌雄蟲壽命期望變化不一，而在MF86的雌蟲壽命期望明顯高于雄蟲。水稻在感病的情況下，兩個品系褐飛虱各齡期的壽命期望值均略有降低，生活史周期均有所縮短，雌蟲壽命期望均略高于雄蟲（圖3）。

圖3 褐飛虱壽命期望Fig.3 Life expectancy of BPH

各組處理1齡若蟲初始的生殖價值數值與其周限增長率相同；
褐飛虱對后代的生殖價值隨齡期的增加越來越高，雌蟲期可達峰值。取食感病MF86的褐飛虱生殖價值曲線與其他品系存在差異，其4、5齡若蟲的生殖價值明顯低于其他3組處理。取食未感病MH3301的褐飛虱雌蟲生殖價值最大值出現在30日齡左右，最大值為46左右；
取食感病水稻MH3301的褐飛虱雌蟲生殖價值明顯大于取食未感病水稻的，最大值出現在28日齡左右，最大值為80左右。取食未感病的MF86水稻的褐飛虱雌蟲生殖價值曲線出現兩個峰值，最大值高達112左右；
而取食感病水稻的褐飛虱雌蟲生殖價值曲線非常平緩，生殖價值極低，最大值僅為12左右（圖4）。

圖4 褐飛虱生殖價值Fig.4 Reproductive value (Vxj)

2.6 褐飛虱穩定年齡-齡期分布和種群預測

除取食感病MF86的褐飛虱卵期的穩定年齡-齡期分布曲線較低外，其他各組處理卵期和若蟲期褐飛虱的穩定年齡-齡期分布圖基本相似。各組處理成蟲期褐飛虱的穩定年齡-齡期分布圖形狀也基本相似，均呈現雌、雄蟲所占比例交替領先的狀態；
但MF86水稻飼養下的成蟲穩定年齡-齡期分布圖差異顯著，取食未感病水稻成蟲的穩定年齡-齡期分布圖較低，而取食感病水稻成蟲的穩定年齡-齡期分布圖顯著較高（圖5）。

圖5 褐飛虱年齡-齡期分布Fig.5 Stable age-stage distribution of BPH

以 80粒有效卵為起始作褐飛虱在 4組處理下的種群動態預測圖，在 100 d的預測期內，褐飛虱在MH3301的兩條種群預測曲線相似，但取食未感病水稻的褐飛虱種群的數量和數量增長速率略高于取食感病水稻的褐飛虱；
取食MF86的褐飛虱兩條種群預測曲線差異明顯，取食未感病水稻的褐飛虱種群的數量和數量增長速率明顯高于取食感病水稻的褐飛虱（圖6）。分齡期作褐飛虱的種群動態預測圖更有利于進行褐飛虱的田間管理、害蟲的預測預報，取食未感病水稻的褐飛虱種群不同齡期的數量增長速率明顯高于取食感病水稻的褐飛虱；
取食MH3301較取食MF86的褐飛虱種群數量和種群不同齡期的數量增長速率均明顯較高（圖7）。

圖6 褐飛虱種群預測（不分齡期）Fig.6 Total population size of BPH

圖7 褐飛虱種群預測（分齡期）Fig.7 Stage structure curves of BPH

外源基因的引入會改變水稻的一些性狀，這可能對群落中的物種產生一定的影響。隨著轉基因抗蟲作物的使用增加，這些作物的潛在環境風險可能會引起關注。通過植物生理學、生態學和基因組學等的研究已經證實，病毒通過直接和間接作用能促進植食性昆蟲的生長、存活和生殖能力。Wang等[23]在研究水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus，RDV）和兩種轉Bt水稻品系T1C-19（cry1C）和T2A-1（cry2A）對非靶標害蟲黑尾葉蟬的潛在綜合影響時發現在RDV感染的轉Bt水稻上，葉蟬卵的持續時間、成蟲體質量和雄成蟲壽命受到顯著影響，而其他參數如卵孵化率、若蟲存活率和繁殖力無顯著影響。Chang等[24]研究表明，無論是否感染水稻矮縮?。≧DV），Bt水稻T1C-19都不會影響非靶標昆蟲褐飛虱的生態適合度。本文結果表明，在未感病情況下，取食MF86較取食MH3301的褐飛虱壽命和生殖力均顯著升高。而在感病情況下，取食MF86較取食MH3301的褐飛虱生殖力明顯降低。另外，取食感病MF86較取食未感病MF86的褐飛虱明顯縮短了世代平均周期，降低了內稟增長率、周限增長率；
取食感病MH3301較取食未感病MH3301的褐飛虱種群動態參數基本無顯著影響。此外也有研究表明，在轉 Bt抗蟲棉對非靶標昆蟲的安全性評價中，兩種轉Bt基因抗蟲棉ZMSJ（Cry1Ac/Cry2Ab）與ZMKCKC（Cry1Ac/EPSPS）對意大利蜜蜂Apis melliferaligusticaSpinola 的存活以及與生長發育相關的重要的生命表參數影響不顯著[25]；
在轉Bt玉米的大田試驗中，轉Bt基因抗蟲玉米DKc5143（event MON88017）對非靶標昆蟲葉蟬沒有產生任何不利影響[26]。在轉Bt水稻的室內試驗中，Bt水稻品系TT51（cry1Ab/cry1Ac水稻）、T1C-19（cry1C水稻）和T2A-1（cry2A水稻）對褐飛虱的生存、發育和繁殖，以及對褐飛虱的消化、解毒和免疫反應等生理過程均無影響[27]。以T1C-19和T2A-1飼養的褐飛虱若蟲或蜜露為食物，對黃腿螯蜂Pseudogonatopus flavifemur(Hymenoptera:Dryinidae) 和稻虱纓小蜂Anagrus nilaparvatae(Hymenoptera: Mymaridae) 的生物學參數沒有顯著影響[28,29]。

從存活率曲線圖可以看出，無論感病與否，取食未感病水稻較取食感病水稻的褐飛虱成蟲期存活率高，取食MH3301較取食MF86的褐飛虱高齡若蟲和成蟲的存活率高。Lu等[30]發現與親本水稻明恢63（MH63）相比，取食T2A-1的黑尾葉蟬若蟲存活率有所提高。從壽命期望圖可以看出，整體上在各處理中褐飛虱雌蟲的壽命期望略高于雄蟲，取食未感病水稻較取食感病水稻的褐飛虱壽命期望高。取食感病MF86的褐飛虱生殖價值圖和種群預測圖與其他處理差異明顯，其生殖價值較低，褐飛虱種群數量和數量增長速率也較低。王海鵬等[31]觀察到轉cry30Fa1水稻株系在單株抗蟲試驗中對褐飛虱有致死作用。

本試驗構建的褐飛虱生命表是在人工氣候室條件下完成的，對于大田稻區更為復雜多變的環境條件下結果是否一致還有待進一步的研究求證。此外，本試驗僅僅較為淺顯地發現了感染 RGDV的 MF86水稻對褐飛虱的生長發育影響顯著，后續也可深入挖掘取食感病水稻的褐飛虱產生顯著性差異的機制，作取食不同水稻的褐飛虱卵巢的比較和轉錄組分析等，從而對病毒介導的轉基因抗蟲水稻進行更為全面準確的評估，為其安全性評價提供科學依據，同時也為后續轉基因抗蟲水稻的推廣種植提供更為可靠的理論支持。